人參皂苷Rg1延緩造血干-祖細胞衰老的機理研究.pdf

1、目的:
　　 最新研究認為,成體干細胞的衰老是生物體衰老的根本原因,因此尋找重新激活衰老干細胞的方法和調(diào)控它靶向分化對延緩衰老和防治老年性疾病至關(guān)重要。造血干/祖細胞(hematopoietic stem cell/hematopoietic progenitor cell,HSC/HPC)是目前研究最為深入的一種成體干細胞,現(xiàn)已證明,HSC/HPC衰老與機體衰老和多種老年性疾病密切相關(guān)。
　　 人參是祖國醫(yī)學重要的“補

2、氣”要藥,人參皂苷是人參的主要藥效成分。研究證明:人參皂苷單體Rgl(百nsenoside Rgl)是人參抗衰老的活性成分,它有明顯延長機體壽命及細胞壽命的作用。迄今尚未見從延緩干細胞衰老角度探討人參抗衰老機理的報道。本課題將干細胞最新的研究技術(shù)與祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的抗衰老理論和對干細胞的認識緊密結(jié)合起來,采用供體HSC/HPC連續(xù)體內(nèi)移植和HSC/HPC體外衰老模型復制等多種現(xiàn)代生物學研究手段,從體內(nèi)和體外兩條途徑系統(tǒng)深入地探討人參皂苷單體

3、Rgl延緩HSC/HPC衰老的作用及其可能的生物學調(diào)控機制。旨在為尋找延緩造血干細胞衰老的方法提供理論指導及實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.免疫磁性分選法(MACS)分離、純化Sca-1+HSC/HPC,流式細胞術(shù)、免疫熒光染色和臺酚藍染色鑒定分選細胞性質(zhì)和檢測細胞活性;
　　 2.三丁基過氧化氫(tert-butylhydroperoxide,t-BHP)誘導Sca-1+HSC/HPC衰老,構(gòu)建細胞衰老體外

4、模型,研究Rgl延緩或治療衰老細胞的體外生物學作用;
　　 3.供體Sca-1+HSC/HPC連續(xù)移植給受致死劑量輻射的受體鼠,構(gòu)建細胞復制性衰老體內(nèi)模型,觀查移植后受體鼠30天存活率,脾結(jié)節(jié)(CFU-S)形成數(shù)量、脾臟指數(shù)及外周血細胞(WBC、HCT、PLT)等恢復情況,PCR檢測脾集落形成細胞及受體鼠骨髓細胞Sry基因表達;研究Rgl延緩或治療衰老細胞的體內(nèi)生物學作用;
　　 4.衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-g

5、al)染色、造血祖細胞混合性集落(CFU-Mix)培養(yǎng)、細胞周期測定,觀察Sca-1+HSC/HPC體內(nèi)、外衰老的細胞生物學特征;研究Rgl在延緩或治療體內(nèi)、外Sca-1+HSC/HPC衰老的作用機理;
　　 5.Western blotting和熒光定量PCR檢測衰老相關(guān)基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cipl/WaflmRNA及細胞周期調(diào)控蛋白P16INK4a、P21Cipl/Wafl、CyclinD1、C

6、yclin E、CDK4、CDK2表達的改變,觀察體內(nèi)、外模型致Sca-1+HSC/HPC衰老的分子生物學機理;研究Rgl延緩或治療Sca-1+HSC/HPC衰老與p16INK4a-Rb和p19Arf-p53-p21Cipl/Wafl信號通路和信號分子之間的關(guān)系;
　　 6.Southern blotting與TRAP-PCR法檢測端粒長度和端粒酶活性變化,觀察體內(nèi)、外衰老模型致Sca-1+HSC/HPC衰老及Rgl延緩和治療S

7、ca-1+HSC/HPC衰老與端粒長度和端粒酶活性變化的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1.流式細胞術(shù)檢測顯示MACS分選前骨髓單個核細胞(MNCs)Sca-1+細胞百分比為(1.8±1.2)％;MACS分離純化后Sca-1+細胞純度可達(87.33±1.25)%。免疫熒光顯示分選前MNCs中僅有(2.7±1.4)%細胞表達Sca-1+,MACS分離純化后有(90.86±1.72)%細胞中達Sca-1+。臺盼藍拒染檢測分選的

8、Sca-1+細胞活性為96%～99%。提示分選的Sca-1+細胞有較高純度和活性。
　　 2.100μmol/L t-BHP作用Sca-1+HSC/HPC6h,細胞出現(xiàn)衰老的生物學特征,SA-β-gal染色陽性細胞率提高、G0/G1期細胞比例增高,形成CFU-Mix集落數(shù)量減少。Rgl延緩或治療體外衰老模型的Sca-1+HSC/HPC后,Sca-1+HSC/HPC的SA-β-gal染色陽性細胞率下降,G0/G0期細胞比例顯著降低

9、,形成CFU-Mix集落數(shù)量增多;Rgl延緩衰老組各檢測指標均較Rgl治療組變化明顯。
　　 3.Sca-1+HSC/HPC連續(xù)移植三代,PCR檢測顯示受體鼠脾集落形成細胞及骨髓細胞Sry基因表達陽性,提示重建受體鼠造血功能的造血細胞來源于雄性供體鼠;隨供體Sca-1+ HSC/HPC移植次數(shù)的增加,受體鼠30天存活率下降,形成CFU-S數(shù)量減少,脾指數(shù)降低,外周血恢復延緩,Sca-1+HSC/HPC出現(xiàn)細胞衰老特征,即SA-β

10、-gal染色陽性細胞率提高、G0/G1期細胞比例增高,形成CFU-Mix集落數(shù)量減少。Rgl延緩或治療衰老方法處理體內(nèi)衰老的Sca-1+HSC/HPC后,受體鼠30天存活率提高,外周血WBC、HCT和PLT明顯恢復加快,Sca-1+HSC/HPC的SA-β-Gal染色陽性率降低、G0/G1期細胞比例降低、形成CFU-Mix集落數(shù)量增多;Rgl延緩衰老組各檢測指標均較Rgl治療組變化明顯。
　　 4.t-BHP作用Sca-1+ H

11、SC/HPC6h,Sca-1+HSC/HPC p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cipl/WaflmRNA及P16INK4a、P21cipl/Wafl、CyclinD1蛋白表達增強,Cydin E、CDK4、CDK2蛋白表達降低。Rgl延緩或治療體外衰老模型的Sca-1+HSCh-IPC后,Sca-1+HSC/HPC p16INK4a、p19Arh、p53、p21Cipl/WaflmRNA及P16INK4a、P21cipl/

12、Wafl、CyclinD1蛋白表達下調(diào),CDK4、CDK2、CyclinE表達上調(diào)。
　　 5.Sca-1+HSC/HPC連續(xù)移植三代,隨移植代數(shù)增加,移植受體鼠Sca-1+HSC/HPC p16INK4a、p19Arf、p53、p21cipl/WaflmRNA及P16INK4a、P21Cipl/Wafl、CyclinD1蛋白表達增強,CDK4、CDK2、CyclinE蛋白表達水平降低。給予Rgl延緩和治療衰老處理后,Sca-1

13、+HSC/HPC衰老體內(nèi)模型的p16INK4a、p19Arf、p53、p21cipl/WmmRNA及P16INK4a、P21cipl/Waf、CyclinD1蛋白表達下調(diào),CDK4、CDK2、CydinE蛋白表達上調(diào)。
　　 6.體內(nèi)及體外衰老模型中,Sca-1+HSC/HPC端粒長度縮短加速,端粒酶活性下降。Rgl延緩和治療Sca-1+HSC/HPC衰老體內(nèi)及體外模型后,其端粒長度縮短減少,端粒酶活性增強。
　　 結(jié)論

14、:
　　 1.采用MACS能成功、有效的分離、純化小鼠Sca-1+HSC/HPC,分離的細胞活性好,純度高。
　　 2.t-BHP能有效誘導Sca-1+HSC/HPC衰老,可用于構(gòu)建體外HSC/HPC衰老模型。Rgl具有延緩及治療t-BHP誘導的Sca-1+HSC/HPC衰老的作用,Rgl延緩衰老比治療衰老效果更好。
　　 3.Sca-1+HSC/HPC連續(xù)移植受體三次,能成功構(gòu)建HSC/HPC體內(nèi)衰老模型。Rg

15、l具有延緩及治療連續(xù)移植過程中Sca-1+HSC/HPC衰老的作用,Rgl延緩衰老比治療衰老效果更好。
　　 4.p16INK4a-Rb、p19Arf-p53-p21Cipl/Wafl信號通路在Sca-1+HSC/HPC衰老及Rgl延緩或治療Sca-1+HSC/HPC衰老中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　 5.端粒長度縮短和端粒酶活性下降可能是Sca-1+HSC/HPC衰老的機制之一;Rgl可能通過激活端粒酶活性和減少端粒長