產(chǎn)果膠酶黑曲霉的紫外誘變及其合成調(diào)節(jié)機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、果膠酶是一種重要的工業(yè)用酶,廣泛應(yīng)用于果汁處理,紡織,造紙和飼料等工業(yè)。本文以一株果膠酶產(chǎn)生菌Aspergillus niger EIM-6為出發(fā)材料,通過反復(fù)紫外誘變處理,最終獲得一株果膠酶高產(chǎn)菌株EIMU2。相較于野生型EIM-6,突變菌株EIMU2的形態(tài)和生長(zhǎng)特征發(fā)生了明顯的改變,主要表現(xiàn)為孢子色澤更黑,孢子團(tuán)大,菌絲與孢子上凝結(jié)有更多的液珠；同時(shí),菌絲更為粗壯,生長(zhǎng)更快。經(jīng)復(fù)篩后EIMU2酶活可達(dá)32161U/mL,較原出發(fā)菌株

2、的初始酶活14539 U/mL提高了1.212倍。進(jìn)一步通過響應(yīng)面法對(duì)EIMU2菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為甜菜渣1.83％,花生餅粉1.69％,(NH4)2SO40.5％,K2HPO40.3％,CaCO30.2％,MgSO40.15％(w/v),接種量6％(v/v),裝液量21.36 mL。優(yōu)化后的突變菌株產(chǎn)酶活性進(jìn)一步提高至98794.3 U/mL,提高了2.07倍。
　　 為了解釋黑曲霉突變后果膠酶高

3、產(chǎn)的產(chǎn)生機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從酶蛋白表達(dá)總量的提高,酶基因自身的突變和多酶復(fù)合體系酶組分及其比例的變化這三個(gè)方面進(jìn)行研究。在相同條件下接種培養(yǎng)野生株EIM-6與突變株EIMU2,發(fā)酵結(jié)束后分別提取它們胞外總蛋白,稱重。對(duì)比發(fā)現(xiàn)突變株EIMU2的胞外總蛋白量較野生株EIM-6提高了14-17％。結(jié)果說明黑曲霉胞外酶蛋白表達(dá)總量的提高果膠酶高產(chǎn)的一個(gè)因?yàn)橹弧?duì)突變菌株EIMU2的胞外總蛋白進(jìn)行蛋白雙向電泳,鑒別該黑曲霉果膠酶復(fù)合體系的酶組分

4、構(gòu)成。通過2-DE凝膠蛋白斑點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)檢索,最終得到5個(gè)與果膠酶降解相關(guān)的蛋白點(diǎn)。這5個(gè)點(diǎn)包含了除原果膠酶以外的其它所有果膠酶組分:聚半乳糖醛酸酶X2、果膠酯酶和果膠裂解酶A,其中果膠裂解酶存在三個(gè)異構(gòu)體。質(zhì)譜分析結(jié)果中得到的果膠酶組分的等電點(diǎn)均處于pI4.0-6.0之間,這也與之前酸性果膠酶的結(jié)論相符合。分別從野生型EIM-6和突變菌株EIMU2中克隆果膠酶主要成分--果膠裂解酶和聚半乳糖醛酸酶的基因、測(cè)序分析,比對(duì),發(fā)現(xiàn)二者

5、的果膠裂解酶與聚半乳糖醛酸酶的基因完全一致,結(jié)果表明突變菌株果膠酶活性的提高不是來源于單一酶自身的基因突變。
　　 進(jìn)一步對(duì)提取的兩株菌的胞外總蛋白(定量后取相同的蛋白量)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。從雙向電泳圖譜上可以看到4個(gè)有明顯差別的蛋白點(diǎn),突變株EIMU2的這4個(gè)蛋白點(diǎn)含量明顯高于EIM-6,其余的蛋白質(zhì)點(diǎn)具有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系,表達(dá)量沒有明顯差異。挖取四個(gè)差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示1號(hào)點(diǎn)為果膠酯酶,2號(hào)點(diǎn)為actib