紫外線輻射對皮膚細胞作用的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、隨著地球臭氧層變薄，紫外線輻射對人類的傷害越來越大。皮膚是直接受到紫外線輻射的器官，受到一定劑量的紫外線輻射后，導致了表皮和真皮細胞的廣泛損傷，最終引起皮膚炎癥反應、免疫抑制、皮膚癌變及皮膚光老化。紫外線照射對皮膚的影響日益成為當今世界皮膚學界研究的重點和熱點。國內(nèi)外對此領域的研究目前主要集中在探討上述各病理反應的分子機制方面。 以人類基因組“工作框架圖”完成為標志，生命科學已進入了后基因組時代，生命科學研究的重心已從揭示生命的

2、所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在分子整體水平對功能的研究，而生命功能的真正執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，因此，研究由功能基因編碼和翻譯的蛋白質(zhì)，已成為生命科學研究的迫切需要和新的任務。由此產(chǎn)生了一門新興學科——蛋白質(zhì)組學(proteomics)。 蛋白質(zhì)組是指基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學是研究細胞、組織或機體在特定的時間和空間上基因組活躍表達的全部蛋白質(zhì)的科學。不同于傳統(tǒng)的單個蛋白質(zhì)或某一類蛋白質(zhì)研究，蛋白質(zhì)組學是研究細胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動態(tài)變化

3、規(guī)律的科學，它是在蛋白質(zhì)水平定量、動態(tài)、整體的研究生物體，并由此在更深層次上獲得對生理、疾病過程以及調(diào)控網(wǎng)絡的廣泛而完整的認識。因而蛋白質(zhì)組學技術是一種整體性、高通量、系統(tǒng)性研究方法。 自1994年澳大利亞學者提出蛋白質(zhì)組概念以來，蛋白質(zhì)組學日益成為近幾年來國外皮膚學研究的熱點。國內(nèi)蛋白質(zhì)組學在皮膚方面的研究尚處起步階段，而國內(nèi)蛋白質(zhì)組學在紫外線對皮膚作用方面的研究還未見報道。 本研究應用蛋白質(zhì)組學雙向電泳技術、質(zhì)譜技術

4、以及計算機數(shù)據(jù)處理技術分離和鑒定紫外線誘導的皮膚細胞差異表達蛋白，從蛋白質(zhì)水平全面系統(tǒng)地研究紫外線輻射對皮膚的影響，從而能夠動態(tài)、整體、高通量地探討紫外線對皮膚光損傷的各種發(fā)病機制及其相互作用途徑，為進一步尋找皮膚光損傷的診斷特異性標志及藥物防治的靶點打下基礎。 研究分為上下兩篇共六個部分，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 上篇：皮膚細胞蛋白質(zhì)組學技術平臺的構(gòu)建 第一部分：人皮膚角質(zhì)形成細胞蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術的建立

5、與優(yōu)化采用體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞HaCaT株，以固相pH梯度——IPG膠條(pH=3～10)進行第一向等電聚焦，以SDS(12.5﹪)均一膠進行第二向分子量垂直電泳，對以上雙向凝膠電泳的關鍵因素與環(huán)節(jié)，如樣品處理、上樣量、電泳參數(shù)、凝膠濃度和SDS凝膠電泳染色方法等進行一系列的條件優(yōu)化。結(jié)果：建立并優(yōu)化人皮膚角質(zhì)形成細胞蛋白質(zhì)組分析所需的雙向凝膠電泳技術，成功地得到了重復性較好的角質(zhì)形成細胞的雙向凝膠電泳圖譜，并提高了其分辨率。

6、第二部分：皮膚成纖維細胞與角質(zhì)形成細胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的比較建立用于皮膚蛋白質(zhì)組學研究的2-DE圖譜數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，采用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離人皮膚成纖維細胞與角質(zhì)形成細胞的總蛋白質(zhì)，獲得分辨率高且重復性較好的人皮膚成纖維細胞與角質(zhì)形成細胞的雙向凝膠電泳圖譜數(shù)據(jù)庫，然后用ImagingMaster2D圖像分析軟件進行比較分析，識別兩者間差異表達的蛋白質(zhì)。結(jié)果：(1)人皮膚成纖維細胞凝膠的平均蛋白質(zhì)點數(shù)為685±34，平均匹配的點

7、數(shù)為593±29，匹配率達86.6﹪；角質(zhì)形成細胞凝膠平均蛋白質(zhì)點數(shù)為592±27，平均匹配的點數(shù)為483±22，匹配率達81.7﹪。(2)通過比較分析上述兩種細胞的雙向凝膠電泳圖譜，得到平均匹配蛋白點數(shù)為315±25。差異表達蛋白點數(shù)為281個，其中117個點僅在成纖維細胞中表達，124個點僅在角質(zhì)形成細胞中表達，126個點在成纖維細胞中為高表達，145個點在成纖維細胞中為低表達。上述結(jié)果表明兩種皮膚主要結(jié)構(gòu)細胞之間存在很多差異表達的

8、蛋白質(zhì)。 第三部分：皮膚細胞蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析方法的建立及肽質(zhì)量指紋圖譜的構(gòu)建體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞與角質(zhì)形成細胞，采用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離其總蛋白質(zhì)，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍G-250染色后，在圖譜上選取2個角質(zhì)形成細胞蛋白點與1個成纖維細胞蛋白點，進行膠內(nèi)酶切、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析鑒定。結(jié)果：獲得3個點的肽質(zhì)量指紋圖譜，經(jīng)Mascot軟件搜索人非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫后鑒定為細胞骨架Actin

9、gamma1、tubulinα2及熱休克蛋白HSP70。皮膚細胞基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析技術的建立為皮膚蛋白質(zhì)組學的進一步研究提供手段。 下篇：紫外線輻射所致皮膚細胞差異表達蛋白的分離與鑒定第四部分：紫外線輻射前后皮膚細胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的差異分析采用UVB(30mJ/cm2)照射人皮膚角質(zhì)形成細胞HaCaT株；UVA(10J/cm2)照射人皮膚成纖維細胞，用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離UV

10、輻射前后各皮膚細胞的總蛋白質(zhì)，凝膠經(jīng)銀染顯色后，ImagingMaster2D圖像分析軟件進行比較分析，識別UV輻射前后各皮膚細胞間差異表達的蛋白質(zhì)。結(jié)果：(1)UVB輻射前后人皮膚角質(zhì)形成細胞HaCaT株凝膠的平均蛋白質(zhì)點數(shù)分別為582±31和595±28，平均匹配的點數(shù)分別為483±29和491±27，匹配率達82.9﹪和82.5﹪。(2)通過比較分析UVB輻射前后人皮膚角質(zhì)形成細胞HaCaT株的雙向凝膠電泳圖譜，得到平均匹配蛋白點

11、數(shù)為433±25。差異表達蛋白點數(shù)為44個，其中5個點僅在UVB輻射前HaCaT株細胞中表達，另15個點僅在UVB輻射后HaCaT株細胞中表達；15個點在UVB輻射后HaCaT株細胞中高表達，9個點在UVB輻射后HaCaT株細胞中低表達。(3)UVA輻射前后人皮膚成纖維細胞凝膠的平均蛋白質(zhì)點數(shù)分別為676±21和693±28，平均匹配的點數(shù)分別為583±29和591±27，匹配率達86﹪和85﹪。(4)通過比較分析UVA輻射前后人皮膚成

12、纖維細胞的雙向凝膠電泳圖譜，得到平均匹配蛋白點數(shù)為563±19。差異表達蛋白點數(shù)為17個，其中1個點僅在UVA輻射前成纖維細胞中表達，另4個點僅在UVA輻射后成纖維細胞中表達；7個點在UVA輻射后成纖維細胞中高表達，5個點在UVA輻射后成纖維細胞中低表達。上述結(jié)果表明UV輻射前后皮膚細胞間存在一些差異表達的蛋白質(zhì)，以上差異點的發(fā)現(xiàn)為進一步研究紫外線對皮膚的影響提供了有益的線索。 第五部分：紫外線輻射前后皮膚細胞差異表達蛋白的質(zhì)譜

13、鑒定和分析分別提取30mJ/cm2UVB照射前后角質(zhì)形成細胞HaCaT株和10J/cm2UVA照射前后成纖維細胞的總蛋白，采用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術進行分離，染色后經(jīng)ImagingMaster2D軟件分析雙向電泳圖譜以發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白，并對部分差異表達蛋白進行膠內(nèi)酶切、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析鑒定。結(jié)果：獲得角質(zhì)形成細胞22個點的肽質(zhì)量指紋圖，以及成纖維細胞17個點的肽質(zhì)量指紋圖。經(jīng)Mascot等

14、軟件搜索人非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫后初步鑒定為一些與細胞骨架、應激保護、能量代謝、物質(zhì)合成分解、細胞增殖和凋亡調(diào)控相關的蛋白，包括：熱休克70蛋白A5，熱休克70蛋白9B，熱休克60蛋白，微管蛋白α2和微管蛋白β5，角蛋白K7、K8、K13、K18和K19，醛縮酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸甘油酸變位酶，烯醇化酶，蛋白酶體α4，蛋白酶體α1，60s酸性核糖核蛋白體蛋白P0，PDLIM1，蛋白酶抑制因子5，硫氧還蛋白過氧化物酶，PHB，翻譯延伸因子，

15、鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅰ，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶，組織蛋白酶B前蛋白酶原，泛素羧基末端水解酶1，F(xiàn)LJ00340蛋白，DJ1蛋白。對它們的功能和與紫外線輻射的可能關系進行了初步探討。上述結(jié)果表明紫外線輻射可以誘導皮膚細胞蛋白質(zhì)組發(fā)生改變，而這些蛋白的變化與皮膚細胞應對紫外線輻射并清除其損傷密切相關。 第六部分：紫外線輻射前后皮膚細胞差異表達蛋白的Western免疫印跡法鑒定分別提取UVA輻射前后皮膚成纖維細胞及UVB輻射前后角質(zhì)形成細胞HaC

16、aT株的總蛋白，采用Western免疫印跡法對HSP70kDaA5、HSP70KDa9B、及HSP60；角蛋白K7、K18和K19；醛縮酶、磷酸甘油酸變位酶及烯醇化酶進行檢測。結(jié)果：(1)熱休克蛋白HSP70kDaA5及熱休克蛋白HSP70KDa9B在UVA輻射后成纖維細胞中表達均增高；烯醇化酶1在UVA輻射后成纖維細胞中表達下降；角蛋白K7在UVA輻射后成纖維細胞中表達增高；(2)熱休克蛋白HSP70KDa9B及熱休克蛋白HSP60在

17、UVB輻射后HaCaT細胞中表達均增高；角蛋白K18和K19在UVB輻射后HaCaT細胞中表達均增高；醛縮酶，磷酸甘油酸變位酶，烯醇化酶1在UVB輻射后HaCaT細胞中表達均明顯下降。以上結(jié)果與先前二維電泳及質(zhì)譜分析結(jié)果基本一致，進一步證實了本研究發(fā)現(xiàn)的紫外線所致皮膚蛋白質(zhì)組學變化。 綜上所述，本研究首次應用蛋白質(zhì)組學雙向電泳技術、質(zhì)譜技術以及計算機數(shù)據(jù)處理技術分析和鑒定紫外線誘導的皮膚細胞蛋白質(zhì)組學變化，發(fā)現(xiàn)了很多差異表達蛋白