番茄熱誘導(dǎo)型ftsH基因的分子克隆、表達(dá)特性及生理功能.pdf

1、FtsH蛋白酶是一種兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侶活性的兼職蛋白，在生物體內(nèi)具有重要功能。原核生物中的FtsH蛋白酶多為脅迫誘導(dǎo)型：在高等植物中，F(xiàn)tsH蛋白酶與光脅迫、低溫以及病害等密切相關(guān)，但對其確切的作用機(jī)制尚不清楚。己在多種原核生物中發(fā)現(xiàn)熱誘導(dǎo)的ftsH基因，而在高等植物中尚未見熱誘導(dǎo)ftsH報(bào)道。為此，我們構(gòu)建了熱誘導(dǎo)的番茄cDNA文庫，通過EST分析從中分離出全長的ftsH基因，將其命名為LeftsH6。對其表達(dá)特

2、性研究充分證明其熱誘導(dǎo)表達(dá)特性；在此基礎(chǔ)上，用反向PCR法克隆了該基因的啟動(dòng)子，通過凝膠阻滯和GUS表達(dá)分析研究該基因的表達(dá)調(diào)控特征。另外，我們構(gòu)建了LeftsH6基因的過量、胞質(zhì)定位(無前導(dǎo)序列的LeftsH6cDNA)和反義的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化番茄，獲得了各種轉(zhuǎn)基因株系，以確定番茄熱誘導(dǎo)型FtsH的生理功能。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1.從熱誘導(dǎo)的番茄cDNA文庫中分離到全長ftsH基因并進(jìn)行了特征分析。該基因序列全長2213bp

3、(注冊號(hào)：AB217916)，包括一個(gè)2019bp的讀碼框，推測的蛋白前體定位到葉綠體中，序列中存在AAA結(jié)構(gòu)域和Zn2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域等已知的金屬蛋白酶FtsH家族的特征結(jié)構(gòu)域。在已克隆的基因中，該FtsH與擬南芥AtFtsH6最近源，被命名為LeftsH6。利用農(nóng)桿菌侵染的方法將含有LeftsH6信號(hào)肽編碼序列和gfp的融合基因轉(zhuǎn)化煙草，GFP熒光表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：GFP在煙草表皮細(xì)胞的葉綠體中表達(dá)，證實(shí)LeftsH6基因具有葉綠體定位的特

4、性。 體外蛋白酶活性分析表明，純化的FtsH具有蛋白水解活性，能降解酪蛋白但不降解BSA；突變的FtsH(Zn2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的谷氨酸Glu472突變?yōu)楣劝滨０稧ln)失去了體外蛋白酶活性。Southern雜交結(jié)果表明，該基因在番茄基因組中是單拷貝；Northern和Western雜交均表明該基因表達(dá)被熱誘導(dǎo)，但其表達(dá)不被低溫、干旱、鹽脅迫、高光等脅迫調(diào)節(jié)。本研究首次證明了高等植物中存在熱誘導(dǎo)的ftsH基因。 2.用反向

5、PCR法從番茄基因組中克隆了LeftsH6基因翻譯起始位點(diǎn)上游1558bp的啟動(dòng)子序列(注冊號(hào)：AB218274)，序列分析表明該啟動(dòng)子中除含有典型的TATA盒和CAAT盒之外，還含有幾組比較典型的熱激元件(HSE)。利用原核誘導(dǎo)表達(dá)的熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA2和放射性標(biāo)記的ftsH啟動(dòng)子片段(包含HSE)進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，證實(shí)LeftsH6啟動(dòng)子中的HSE具有與熱激轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的能力。 將LeftsH6啟動(dòng)子1558bp、58

6、7bp和332bp的片段與gus報(bào)告基因融合構(gòu)建真核表達(dá)載體(pF1558、pF587、pF332)，轉(zhuǎn)化煙草。對pF1558轉(zhuǎn)基因煙草GUS活性檢測表明，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS在熱激的煙草根、葉片和花中高水平表達(dá)。各個(gè)發(fā)育時(shí)期花的子房、柱頭、花藥和萼片，以及成熟花藥的花粉粒均顯示高水平的熱誘導(dǎo)GUS染色。 啟動(dòng)子缺失分析表明，1558bp的啟動(dòng)子介導(dǎo)的GUS熱誘導(dǎo)表達(dá)是最強(qiáng)的；587bp的啟動(dòng)子區(qū)域能夠介導(dǎo)GUS的熱誘導(dǎo)表達(dá)，但明

7、顯弱于1558bp啟動(dòng)子；而332bp的啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)的GUS熱誘導(dǎo)表達(dá)最弱。 GUS熒光定量分析表明：在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中，熱誘導(dǎo)的GUS熒光活性在40℃達(dá)到高峰，與Northern雜交結(jié)果一致。在相同的熱激處理?xiàng)l件下，pF1558轉(zhuǎn)化系顯示出最強(qiáng)的GUS活性，顯著高于pF587和pF332轉(zhuǎn)化系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，LeftsH6是一個(gè)典型的熱激基因，其熱誘導(dǎo)特性是通過LeftsH6啟動(dòng)子的HSE與熱激轉(zhuǎn)錄因子的相互作用介導(dǎo)的。

8、 3.將LeftsH6的全長cDNA序列構(gòu)建到組成型啟動(dòng)子(CaMV35S)控制的pROK2真核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉圓盤法轉(zhuǎn)化番茄，獲得了過量表達(dá)LeftsH6基因的轉(zhuǎn)基因番茄，通過Southern雜交證實(shí)外源基因已整合入番茄基因組，Northern雜交證實(shí)，外源ftsH基因在常溫條件下的番茄轉(zhuǎn)基因株系中呈現(xiàn)組成型表達(dá)，不同的轉(zhuǎn)基因株系LeftsH6表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度有差別。 過量轉(zhuǎn)基因番茄

9、營養(yǎng)生長正常，但生殖生長出現(xiàn)障礙。首先表現(xiàn)在花粉高度敗育，不能正常座果。通過RT-PCR/Southern雜交證實(shí)了在過量轉(zhuǎn)基因番茄的花藥中LeftsH6呈現(xiàn)組成型表達(dá)；而在未轉(zhuǎn)基因株中，只有在熱激條件下花藥中才有LeftsH6的表達(dá)。LeftsH6基因在番茄花藥中熱誘導(dǎo)表達(dá)特性的改變是引發(fā)花粉敗育的根本原因。石蠟切片觀察表明，轉(zhuǎn)基因番茄的花粉在減數(shù)分裂過程中發(fā)生異常，出現(xiàn)形狀不規(guī)則的小孢子。其次，用未轉(zhuǎn)基因番茄株的正?；ǚ圻M(jìn)行人工授粉

10、，能使子房膨大，獲得雜交果實(shí)，但雜交果實(shí)中的種子嚴(yán)重?cái)∮?，完全喪失生活力。推測LeFtsH6不僅參與了高溫下的小孢子發(fā)育過程，而且與授粉后的種子發(fā)育過程有關(guān)。 4.將LeftsH6基因中編碼信號(hào)肽的序列打掉，構(gòu)建到真核表達(dá)載體中轉(zhuǎn)化番茄，獲得了胞質(zhì)定位的LeftsH6轉(zhuǎn)基因番茄。Northern雜交表明，外源基因在胞質(zhì)定位轉(zhuǎn)基因番茄中實(shí)現(xiàn)組成型表達(dá)。胞質(zhì)定位轉(zhuǎn)基因番茄能夠正常生長、開花、結(jié)實(shí)，T1代幼苗耐熱性分析表明與對照株無明

11、顯差異。該結(jié)果表明，葉綠體LeFtsH6蛋白酶的正確定位對于其發(fā)揮功能是至關(guān)重要的。 5.以LeftsH6基因5'端548bp片段構(gòu)建反義載體，轉(zhuǎn)化番茄，獲得了LeftsH6反義株系，通過Northern雜交證明在高溫條件下內(nèi)源LeftsH6基因的表達(dá)明顯被抑制。在正常生長條件下，反義轉(zhuǎn)基因番茄株與對照株相比，在生長勢、株高、植株形態(tài)、葉形葉色、花序形態(tài)方面均無明顯差異；開花期，通過花粉染色檢查小孢子發(fā)育情況，95％以上花粉渾圓

12、、飽滿、染色深，表明絕大多數(shù)花粉可育，與對照檢查結(jié)果一致。反義轉(zhuǎn)基因番茄能正常座果，并能產(chǎn)生正常、飽滿的種子。 用反義株T3代幼苗進(jìn)行高溫脅迫處理，表明反義轉(zhuǎn)基因株比對照株更容易受傷害。對熱激脅迫后的葉綠素?zé)晒馓匦詼y定結(jié)果表明：反義株與對照株相比，具有更高的初始熒光(Fo)和較低的Fv/Fm(反映PSⅡ光化學(xué)效率)，說明反義株遭受更嚴(yán)重的傷害，光化學(xué)效率下降更顯著，而且更難恢復(fù)正常生長。表明反義株系內(nèi)源LeftsH6表達(dá)水平的降

13、低增強(qiáng)了植株對熱脅迫的敏感性。 本論文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：1.首次從高等植物中克隆了熱誘導(dǎo)的ftsH基因，通過Northern和Western雜交充分證明了其熱誘導(dǎo)表達(dá)特性?？寺×藷嵴T導(dǎo)LeftsH6基因1558bp的啟動(dòng)子序列，證明該啟動(dòng)子中的HSE與純化的HSF有結(jié)合活性。在三種不同長度LeftsH6啟動(dòng)子(1558bp、587bp、332bp)驅(qū)動(dòng)gus基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草中，1558bp的LeftsH6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS熱誘導(dǎo)表