番茄SlWHY2基因的克隆、表達(dá)和功能分析.pdf

1、植物在整個(gè)生長(zhǎng)過程中，不可避免的會(huì)受到來(lái)自外界環(huán)境因子的各種刺激，如干旱、鹽漬和低溫等非生物脅迫及病蟲侵害等。植物自身在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了抵抗各種生物脅迫和非生物脅迫的防御機(jī)制。干旱脅迫作為我國(guó)北方地區(qū)常見的非生物脅迫，影響番茄的生長(zhǎng)發(fā)育，表現(xiàn)在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和生化方面的變化，最終造成減產(chǎn)。此外，病蟲侵害也是影響番茄正常生長(zhǎng)發(fā)育的因素之一。WHIRLY轉(zhuǎn)錄因子作為植物體內(nèi)特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，可以通過響應(yīng)干旱及病害的刺激，調(diào)控編碼不同

2、抗氧化酶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控酶活性，調(diào)控脅迫相關(guān)基因及抗病相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)植物的抗旱性和抗病性。
　　在本試驗(yàn)中克隆得到番茄WHIRLY轉(zhuǎn)錄因子SlWHY2基因，以轉(zhuǎn)基因煙草作為試驗(yàn)材料，研究了SlWHY2轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下對(duì)活性氧的清除能力及其在抗病等方面的影響。本試驗(yàn)主要結(jié)果如下：
　?。?）據(jù)NCBI得到該轉(zhuǎn)錄因子的mRNA序列，GenBank編碼號(hào)：XM_010314783。SlWHY2全長(zhǎng)1162bp，開放閱讀

3、框?yàn)?26bp，編碼241個(gè)氨基酸。
　?。?）利用qRT-PCR對(duì)SlWHY2在番茄中表達(dá)特性分析表明，SlWHY2基因在葉片中的表達(dá)量高于其他組織；轉(zhuǎn)錄水平受聚乙二醇，氯化鈉，水楊酸和過氧化氫的誘導(dǎo)表達(dá)。此外，SlWHY2的表達(dá)還受到青枯假單胞菌的誘導(dǎo)。
　?。?）構(gòu)建了SlWHY2的pBI121載體，轉(zhuǎn)化野生型煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，通過PCR和qRT-PCR的方法篩選過表達(dá)植株，從中選取不同表達(dá)量的三個(gè)株系（OE-

4、1，OE-3，OE-5）作為后續(xù)試驗(yàn)材料。
　?。?）在正常的生長(zhǎng)條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因煙草植株表型無(wú)明顯差異。在干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系幼苗及成苗的生長(zhǎng)狀態(tài)要優(yōu)于野生型。DAB、N B T染色結(jié)果顯示，干旱處理后，野生型葉片顏色深于轉(zhuǎn)基因煙草，H2O2和O2-含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步表明野生型煙草的活性氧積累量高于轉(zhuǎn)基因煙草，且轉(zhuǎn)基因煙草的酶活性及相關(guān)酶基因表達(dá)水平均高于野生型。這說明SlWHY2過表達(dá)提高了煙草抗氧化能力，緩解活性

5、氧對(duì)植株的氧化毒害作用。
　?。?）測(cè)定干旱處理后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型葉片的相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛以及游離脯氨酸的含量，結(jié)果表明野生型植株的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量明顯高于轉(zhuǎn)基因株系，而相對(duì)含水量和游離脯氨酸含量則低于轉(zhuǎn)基因煙草。試驗(yàn)進(jìn)一步說明過表達(dá)SlWHY2提高煙草的抗?jié)B透脅迫能力。
　?。?）用青枯假單胞菌分別噴施、注射過表達(dá)和野生型煙草后，通過DAB和臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草過氧化氫積累量及細(xì)胞死亡數(shù)均低于野生型