番茄SlAN2基因的克隆、表達和功能分析.pdf

1、花青素是類黃酮途徑的產(chǎn)物之一，近年來受到越來越多的關(guān)注?；ㄇ嗨氐姆e累受一系列環(huán)境和發(fā)育信號的誘導?；ㄇ嗨厥且环N抗氧化物質(zhì)和光保護屏障，同時它在光保護、抗逆、授粉以及種子傳播等許多生理過程中都發(fā)揮著重要的作用。另外，人類膳食中的花青素對健康也十分有益?；ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平?；ㄇ嗨睾铣上嚓P(guān)的結(jié)構(gòu)基因受轉(zhuǎn)錄復合體激活，這些復合體由R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD重復蛋白組成。SlAN2編碼一個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄

2、因子，調(diào)控番茄花青素的合成。
　　植物遭受非生物脅迫時，體內(nèi)代謝失衡會導致活性氧(ROS)大量積累。當脅迫加劇時，過量積累的ROS會對植物造成一系列的損傷。幸運的是，植物進化出了許多適應機制來對抗ROS的傷害，這些機制包括酶促和非酶促抗氧化防御體系。類胡蘿卜素，抗壞血酸，谷胱甘肽以及類黃酮等都屬于非酶促的抗氧化物質(zhì)，它們可以清除ROS從而保護植物免受損害?；ㄇ嗨鼐褪且环N抗氧化物質(zhì)，它的抗氧化性能主要歸功于糖基上的羥基。番茄是研究果

3、實成熟的模式植物，然而SlAN2與果實成熟的關(guān)系還不清楚。
　　本研究從番茄中克隆得到SlAN2基因，并對該基因的表達和功能進行分析，主要結(jié)果如下:
　　(1)分離得到SlAN2基因，包含一個828個堿基的開放閱讀框，能編碼275個氨基酸。
　　(2)將SlAN2-GFP融合蛋白在洋蔥表皮中瞬時表達，觀察到該融合蛋白定位在細胞核中。
　　(3)實時定量PCR(qRT-PCR)表明SlAN2的轉(zhuǎn)錄水平在莖中最高，在

4、葉、花和根中水平適中，在果實中最低。SlAN2的表達水平受低溫以及甲基紫晶(MV)的誘導上調(diào)。
　　(4)構(gòu)建正、反義表達載體，利用農(nóng)桿菌進行番茄和煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得正、反義轉(zhuǎn)基因番茄植株和正義轉(zhuǎn)基因煙草植株。對有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄和煙草植株進行qRT-PCR檢測，結(jié)果證明成功地獲得了正、反義轉(zhuǎn)基因番茄植株和正義轉(zhuǎn)基因煙草植株。正義轉(zhuǎn)基因番茄葉片的花青素含量升高，為野生型番茄的2.2-3.2倍，過表達SlAN2的煙草葉片花青素

5、含量升高了100-284倍。
　　(5)與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草通過維持更高的葉綠素含量，凈光合速率和光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學效率來抵御低溫脅迫。另外，在遭受低溫脅迫時，轉(zhuǎn)基因煙草的離子滲透更少，ROS水平更低，非酶促抗氧化性能更高。轉(zhuǎn)基因煙草對由MV誘發(fā)的氧化脅迫的抗性也更強。與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草在遭受氧化脅迫時，葉綠素含量降低的更少，離子滲透更少，能維持更高的光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學效率。這些結(jié)果表明，SlAN2在煙草中的

6、過量表達，使得轉(zhuǎn)基因煙草中花青素大量積累，增強了轉(zhuǎn)基因煙草對低溫和氧化脅迫的抗性。
　　(6)與野生型番茄相比，轉(zhuǎn)基因番茄在抵御高溫脅迫時，能夠維持更高的鮮重、凈光合速率和光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學效率。另外，與野生型番茄相比，轉(zhuǎn)基因番茄在遭受高溫脅迫時，有更強的非酶促抗氧化性能，能維持更低的ROS水平和更高的PSⅡ反應中心D1蛋白含量。這些結(jié)果說明，SlAN2在抵御高溫脅迫時發(fā)揮著重要作用。
　　(7)過表達SlAN2的番茄果實