IFRG15蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育中的功能研究及機制探索.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、哺乳動物生殖細胞在減數(shù)分裂過程中,其基因組是轉(zhuǎn)錄沉默的。小鼠的胚胎基因組激活開始于2細胞晚期;而人胚胎基因組的激活發(fā)生于4-8細胞期。在合子基因組激活(zygotic genome activation,ZGA)之前,胚胎的發(fā)育由母源因子所調(diào)控,這些因子在卵母細胞發(fā)生過程中積累,并儲存于成熟卵母細胞的胞質(zhì)中。在卵子受精或核移植的胚胎激活后,這些母源因子啟動植入前胚胎的發(fā)育,胚胎基因組開始轉(zhuǎn)錄,表達新的基因,合成新的因子,并發(fā)生級聯(lián)反應(yīng),

2、從而合成更多的細胞因子,維持植入前胚胎繼續(xù)發(fā)育。即使合子基因組激活之后,母源蛋白仍可以與胚胎自身新產(chǎn)生的蛋白共同作用,完成對植入前胚胎發(fā)育過程的精確調(diào)控。因此對母源因子的研究將有助于我們深入了解植入前胚胎發(fā)育過程中的重要事件和調(diào)控機制,并為尋找早期胚胎體外發(fā)育阻滯的原因以及提高體外胚胎培養(yǎng)的效率提供理論基礎(chǔ)。
  干擾素應(yīng)答基因15(interferon alpha responsive gene15,IFRG15)是本實驗室前期

3、從小鼠的MⅡ期卵母細胞蛋白表達譜中鑒定得到的一個特異性高表達的蛋白質(zhì)。作為一個較新的蛋白,其在卵母細胞及植入前胚胎中所起的生理功能仍不清楚。有研究證實:家兔卵母細胞及植入前胚胎中檢測到Ifrg15 mRNA的表達,推測該基因?qū)χ踩肭芭咛サ陌l(fā)育具有一定的影響。因此,為了深入了解IFRG15蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育過程中所發(fā)揮的生物學(xué)功能及作用機制,我們在本論文中,從以下三個部分展開研究:
  1.分析IFRG15基本的生物學(xué)信息及其

4、表達模式;
  2.研究IFRG15在小鼠植入前胚胎發(fā)育中所發(fā)揮的生物學(xué)功能;
  3.探索IFRG15影響小鼠植入前胚胎發(fā)育過程的潛在分子機制。
  首先,我們通過NCBI及ENSEMBLE網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫分析了IFRG15基本的生物學(xué)信息:IFRG15蛋白由Torlaip2基因編碼,該基因共產(chǎn)生9個轉(zhuǎn)錄本,其中4個轉(zhuǎn)錄本編碼131個氨基酸,產(chǎn)生IFRG15蛋白。運用實時熒光定量PCR技術(shù)(quantitative Rea

5、l-Time PCR,qRT-PCR)檢測了Ifrg15 mRNA的表達模式。結(jié)果顯示:Ifrg15 mRNA在生殖系統(tǒng)中高表達;在生發(fā)泡(germinal vesicle,GV)期卵母細胞、停滯于第二次減數(shù)分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)卵母細胞和受精卵中均有表達,2-細胞階段其表達量顯著升高且在植入前胚胎中維持較高水平。此表達模式提示:IFRG15蛋白可能作為一種母源因子儲存于成熟卵母細胞中,并在植入前胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作

6、用。
  其次,我們利用顯微注射小于擾RNA(small interfering RNA,siRNA)片段技術(shù),特異性沉默Ifrg15在小鼠植入前胚胎及NIH-3T3細胞系中的表達,以探究IFRG15所發(fā)揮的生物學(xué)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性阻斷IFRG15蛋白的胚胎發(fā)育明顯受阻于1-細胞階段,并且發(fā)育受阻的程度與siRNA濃度呈明顯的劑量依賴關(guān)系。然而,將特異性siRNA注射入2-細胞階段胚胎中的單個卵裂球中,注射組胚胎仍可發(fā)育為3-細

7、胞。由此推測:IFRG15蛋白并不是特異性阻斷第一次卵裂過程,而是抑制了植入前早期胚胎發(fā)育過程中的細胞周期進程。此外利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將siRNA片段轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細胞系中,結(jié)果表明:體細胞中并沒有出現(xiàn)細胞周期阻滯。上述結(jié)果證實:IFRG15蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮了特有的生理調(diào)控功能。
  再次,本研究聯(lián)合利用活細胞工作站及顯微注射技術(shù)以確定Ifrg15表達沉默導(dǎo)致植入前胚胎發(fā)育阻滯的確切時間點。實時觀察發(fā)現(xiàn):IFR

8、G15特異性沉默后,受精卵雌雄原核能夠正??拷竭_受精卵中央,但融合異常。EdU摻入實驗結(jié)果顯示:阻斷IFRG15蛋白的表達并不影響DNA的復(fù)制,由此表明Ifrg15特異性siRNA干涉組的受精卵能夠正常進入S期,但不能進入M期,由此推測受精卵阻滯于S期晚期或G2期。隨后利用免疫熒光技術(shù)分別檢測了DNA雙鏈斷裂特異性標志物γH2AX及DNA損傷檢測點活化的特異性標志物ATM(ataxiatelangiectasia-mutated ge

9、ne)的表達情況,結(jié)果提示:Ifrg15干涉組受精卵中γH2AX的表達量明顯高于正常組及對照組;正常組與對照組的受精卵中均沒有ATM的表達,而Ifrg15干涉組受精卵中有ATM的表達。此外,對ZGA起始的特異性標志物的檢測發(fā)現(xiàn):Ifrg15特異性沉默的受精卵中MuERV-L(murine endogenousretrovirus-like)、EIF-1 a(eukaryotic translation initiation factor

10、 A)、HSP70.1(heatshock protein70.1)及U2AFBP的表達量顯著低于正常組。由此可見,特異性沉默IFRG15蛋白的表達可以導(dǎo)致DNA損傷,從而激活細胞周期中G2期DNA損傷檢測點,并引起合子轉(zhuǎn)錄本激活失敗,由此引發(fā)了細胞周期阻滯。
  最后,本研究進一步進行了受精卵沉默Ifrg15后轉(zhuǎn)錄組高通量測序的研究,結(jié)果顯示:Ifrg15干涉組與對照組相比共鑒定出1445個差異基因,其中上調(diào)基因1086個,而下

11、調(diào)基因359個。其中有相當部分的基因參與細胞周期、生殖等過程中,提示這些基因可能由IFRG15所介導(dǎo),進而影響植入前胚胎發(fā)育過程。
  綜上所述,本研究首次證實了IFRG15蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育過程的細胞周期中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,并探索了IFRG15蛋白影響小鼠植入前胚胎發(fā)育的相關(guān)機制。同時,本研究對差異蛋白進行分析,深入闡釋了IFRG15蛋白引起DNA損傷的潛在分子機制,從而增進人們對其在ZGA及植入前胚胎發(fā)育調(diào)控中的認識

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