IFRG15蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育中的功能研究及機(jī)制探索.pdf

1、哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中，其基因組是轉(zhuǎn)錄沉默的。小鼠的胚胎基因組激活開始于2細(xì)胞晚期;而人胚胎基因組的激活發(fā)生于4-8細(xì)胞期。在合子基因組激活(zygotic genome activation，ZGA)之前，胚胎的發(fā)育由母源因子所調(diào)控，這些因子在卵母細(xì)胞發(fā)生過程中積累，并儲(chǔ)存于成熟卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中。在卵子受精或核移植的胚胎激活后，這些母源因子啟動(dòng)植入前胚胎的發(fā)育，胚胎基因組開始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)新的基因，合成新的因子，并發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，

2、從而合成更多的細(xì)胞因子，維持植入前胚胎繼續(xù)發(fā)育。即使合子基因組激活之后，母源蛋白仍可以與胚胎自身新產(chǎn)生的蛋白共同作用，完成對(duì)植入前胚胎發(fā)育過程的精確調(diào)控。因此對(duì)母源因子的研究將有助于我們深入了解植入前胚胎發(fā)育過程中的重要事件和調(diào)控機(jī)制，并為尋找早期胚胎體外發(fā)育阻滯的原因以及提高體外胚胎培養(yǎng)的效率提供理論基礎(chǔ)。
　　干擾素應(yīng)答基因15(interferon alpha responsive gene15，IFRG15)是本實(shí)驗(yàn)室前期

3、從小鼠的MⅡ期卵母細(xì)胞蛋白表達(dá)譜中鑒定得到的一個(gè)特異性高表達(dá)的蛋白質(zhì)。作為一個(gè)較新的蛋白，其在卵母細(xì)胞及植入前胚胎中所起的生理功能仍不清楚。有研究證實(shí):家兔卵母細(xì)胞及植入前胚胎中檢測(cè)到Ifrg15 mRNA的表達(dá)，推測(cè)該基因?qū)χ踩肭芭咛サ陌l(fā)育具有一定的影響。因此，為了深入了解IFRG15蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育過程中所發(fā)揮的生物學(xué)功能及作用機(jī)制，我們?cè)诒菊撐闹校瑥囊韵氯齻€(gè)部分展開研究:
　　1.分析IFRG15基本的生物學(xué)信息及其

4、表達(dá)模式;
　　2.研究IFRG15在小鼠植入前胚胎發(fā)育中所發(fā)揮的生物學(xué)功能;
　　3.探索IFRG15影響小鼠植入前胚胎發(fā)育過程的潛在分子機(jī)制。
　　首先，我們通過NCBI及ENSEMBLE網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)分析了IFRG15基本的生物學(xué)信息:IFRG15蛋白由Torlaip2基因編碼，該基因共產(chǎn)生9個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中4個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼131個(gè)氨基酸，產(chǎn)生IFRG15蛋白。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(quantitative Rea

5、l-Time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)了Ifrg15 mRNA的表達(dá)模式。結(jié)果顯示:Ifrg15 mRNA在生殖系統(tǒng)中高表達(dá);在生發(fā)泡(germinal vesicle，GV)期卵母細(xì)胞、停滯于第二次減數(shù)分裂中期（metaphaseⅡ，MⅡ）卵母細(xì)胞和受精卵中均有表達(dá)，2-細(xì)胞階段其表達(dá)量顯著升高且在植入前胚胎中維持較高水平。此表達(dá)模式提示:IFRG15蛋白可能作為一種母源因子儲(chǔ)存于成熟卵母細(xì)胞中，并在植入前胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作

6、用。
　　其次，我們利用顯微注射小于擾RNA(small interfering RNA，siRNA)片段技術(shù)，特異性沉默Ifrg15在小鼠植入前胚胎及NIH-3T3細(xì)胞系中的表達(dá)，以探究IFRG15所發(fā)揮的生物學(xué)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性阻斷IFRG15蛋白的胚胎發(fā)育明顯受阻于1-細(xì)胞階段，并且發(fā)育受阻的程度與siRNA濃度呈明顯的劑量依賴關(guān)系。然而，將特異性siRNA注射入2-細(xì)胞階段胚胎中的單個(gè)卵裂球中，注射組胚胎仍可發(fā)育為3-細(xì)

7、胞。由此推測(cè):IFRG15蛋白并不是特異性阻斷第一次卵裂過程，而是抑制了植入前早期胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞周期進(jìn)程。此外利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將siRNA片段轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細(xì)胞系中，結(jié)果表明:體細(xì)胞中并沒有出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯。上述結(jié)果證實(shí):IFRG15蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮了特有的生理調(diào)控功能。
　　再次，本研究聯(lián)合利用活細(xì)胞工作站及顯微注射技術(shù)以確定Ifrg15表達(dá)沉默導(dǎo)致植入前胚胎發(fā)育阻滯的確切時(shí)間點(diǎn)。實(shí)時(shí)觀察發(fā)現(xiàn):IFR

8、G15特異性沉默后，受精卵雌雄原核能夠正常靠近到達(dá)受精卵中央，但融合異常。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:阻斷IFRG15蛋白的表達(dá)并不影響DNA的復(fù)制，由此表明Ifrg15特異性siRNA干涉組的受精卵能夠正常進(jìn)入S期，但不能進(jìn)入M期，由此推測(cè)受精卵阻滯于S期晚期或G2期。隨后利用免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)了DNA雙鏈斷裂特異性標(biāo)志物γH2AX及DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)活化的特異性標(biāo)志物ATM(ataxiatelangiectasia-mutated ge

9、ne)的表達(dá)情況，結(jié)果提示:Ifrg15干涉組受精卵中γH2AX的表達(dá)量明顯高于正常組及對(duì)照組;正常組與對(duì)照組的受精卵中均沒有ATM的表達(dá)，而Ifrg15干涉組受精卵中有ATM的表達(dá)。此外，對(duì)ZGA起始的特異性標(biāo)志物的檢測(cè)發(fā)現(xiàn):Ifrg15特異性沉默的受精卵中MuERV-L(murine endogenousretrovirus-like)、EIF-1 a(eukaryotic translation initiation factor

10、 A)、HSP70.1(heatshock protein70.1)及U2AFBP的表達(dá)量顯著低于正常組。由此可見，特異性沉默IFRG15蛋白的表達(dá)可以導(dǎo)致DNA損傷，從而激活細(xì)胞周期中G2期DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)，并引起合子轉(zhuǎn)錄本激活失敗，由此引發(fā)了細(xì)胞周期阻滯。
　　最后，本研究進(jìn)一步進(jìn)行了受精卵沉默Ifrg15后轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序的研究，結(jié)果顯示:Ifrg15干涉組與對(duì)照組相比共鑒定出1445個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因1086個(gè)，而下

11、調(diào)基因359個(gè)。其中有相當(dāng)部分的基因參與細(xì)胞周期、生殖等過程中，提示這些基因可能由IFRG15所介導(dǎo)，進(jìn)而影響植入前胚胎發(fā)育過程。
　　綜上所述，本研究首次證實(shí)了IFRG15蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育過程的細(xì)胞周期中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，并探索了IFRG15蛋白影響小鼠植入前胚胎發(fā)育的相關(guān)機(jī)制。同時(shí)，本研究對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析，深入闡釋了IFRG15蛋白引起DNA損傷的潛在分子機(jī)制，從而增進(jìn)人們對(duì)其在ZGA及植入前胚胎發(fā)育調(diào)控中的認(rèn)識(shí)