miR-291a-b-5p在小鼠著床前胚胎發(fā)育的表達變化及作用研究.pdf

1、目的：
　　哺乳動物著床前胚胎發(fā)育、分化及胚胎基因組激活的調控機制是生殖醫(yī)學研究領域的難點和熱點問題之一。研究著床前胚胎基因表達調控機制，對于深入認識著床前胚胎發(fā)育過程，提高人類輔助生殖助孕技術的成功率，揭示不孕與不育、出生缺陷及某些遺傳性疾病的發(fā)病機理有重要意義。由于小鼠基因組和人類基因組具有廣泛的同源性；同時，小鼠胚胎和人類胚胎具有許多共同的特征。因此，對于小鼠胚胎發(fā)育的研究，可以幫助人們深入認識人類胚胎發(fā)育的過程。近年研究發(fā)

2、現(xiàn)，mir-290簇在小鼠著床前胚胎中特異性高表達，但其對小鼠著床前胚胎發(fā)育的具體作用和調控機理仍未闡明。近期數(shù)據(jù)顯示，microRNA可通過靶向自噬相關基因參與調控細胞自噬水平，介導細胞應對饑餓、生長因子缺失、內質網(wǎng)應激和病原體感染等應激環(huán)境。自噬是細胞分解代謝的重要生理過程。在胚胎發(fā)育過程中，自噬在卵母細胞向受精卵轉化過程中發(fā)揮了降解母源性物質、提供氨基酸能量和維持細胞內穩(wěn)態(tài)的重要作用。有學者在對小鼠黑色素瘤細胞的研究中，發(fā)現(xiàn)mir

3、-290簇可靶向作用于自噬相關基因Atg7和ULK1，抑制腫瘤細胞的自噬性死亡。但是，在小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中，mir-290簇是否可通過自噬相關基因參與調控著床前胚胎發(fā)育，其具體作用如何仍然未知。綜上，本研究通過生物信息學分析，選擇 mir-290簇中的miR-291a/b-5p為研究對象，旨在研究其對自噬相關基因Atg5和Becn1的作用及自噬的影響，以及其在小鼠著床前胚胎發(fā)育中的作用和相關機制。
　　方法：
　　1、

4、獲取小鼠不同發(fā)育階段著床前胚胎。對4周齡C57BL/6J雌鼠進行超數(shù)排卵，與8周齡C57BL/6J公鼠交配，次日早晨檢查陰栓；根據(jù)胚胎發(fā)育時間，在體視顯微鏡下收集不同階段的小鼠著床前胚胎。
　　2、提取小鼠胚胎微量RNA并進行Real Time PCR檢測。使用PicoPure? RNA Isolation Kit提取微量胚胎標本的RNA，使用SYBR? PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit試劑盒，對提取的

5、RNA樣品進行可同時應用于microRNA和mRNA檢測的反轉錄反應，進行Real Time PCR檢測。
　　3、小鼠胚胎免疫熒光檢測。胚胎免疫熒光檢測自噬體相關蛋白LC3B和溶酶體膜蛋白 LAMP，觀察小鼠著床前胚胎不同發(fā)育階段胞漿中自噬體及自噬溶酶體形成的動態(tài)變化。將采集的小鼠胚胎置入1％PFA+0.2%Triton?X-100，室溫放置于暗濕盒中1小時，進行同步固定和穿透。在體視顯微鏡下洗胚、封閉、抗體孵育和核復染。熒光顯

6、微鏡下觀察并照相。
　　4、小鼠胚胎透射電鏡標本制備與檢測。在體視顯微鏡下，收集200枚胚胎，移入輸卵管壺腹部，將包埋胚胎樣本的輸卵管轉移入預冷的3%戊二醛中，4℃過夜固定后，進行后續(xù)常規(guī)透射電鏡標本制備并拍照觀察。
　　5、雙熒光素酶報告基因實驗。生物信息學軟件分析 miR-291a/b-5p對 Atg5和Becn1的靶向序列，構建含有靶向結合序列的報告基因載體，在小鼠胚胎來源的NIH/3T3細胞中驗證miR-291a/b

7、-5p對Atg5和Becn1的靶向作用關系。
　　6、在NIH/3T3細胞中過表達miR-291a/b-5p，western blot檢測其對細胞中Atg5和Becn1 mRNA和蛋白表達的影響；以及對細胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化的影響；共轉染EGFP-LC3和miR-291a-5p，熒光顯微鏡下觀察miR-291a-5p對EGFP-LC3聚集光斑陽性細胞數(shù)目的影響。
　　7、胚胎顯微注射和體外培養(yǎng)。超數(shù)排卵和交配后，體

8、視顯微鏡下采集C57BL/6J小鼠1-cell期胚胎，對胞漿顯微注射5’FAM修飾的miR-291a-5p inhibitor，將注射后胚胎進行體外培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察miR-291a-5p inhibitor在小鼠胚胎早期發(fā)育中的表達分布，Real Time PCR檢測miR-291a-5p inhibitor對胚胎中miR-291a-5p的抑制效應、對Atg5和Becn1 mRNA表達的作用，以及其對小鼠胚胎早期發(fā)育的影響。

9、　　結果：
　　1、miR-291a/b-5p和自噬相關基因Atg5及Becn1在小鼠著床前胚胎中的表達呈動態(tài)變化。在2~4-cell階段，miR-291a/b-5p表達升高，而Atg5和Becn1 mRNA的表達下降，其相互之間的表達趨勢呈反向的對應關系。
　　2、胚胎免疫熒光監(jiān)測小鼠著床前胚胎中自噬體形成及自噬溶酶體形成的變化。結果顯示受精后1-cell期胚胎中自噬體及自噬溶酶體形成增加，從2-cell發(fā)育階段開始減少，

10、4~8-cell發(fā)育階段明顯減少。
　　3、胚胎透射電鏡檢測顯示1-cell期受精卵胞漿中出現(xiàn)自噬體雙層膜結構，而未受精的卵母細胞胞漿中未觀察到該結構。
　　4、雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-291a/b-5p對Atg5和Becn1具有靶向抑制作用；miR-291a/b-5p可靶向抑制NIH/3T3細胞中Atg5和Becn1 mRNA和蛋白的表達；miR-291a-5p可抑制雷帕霉素誘導的細胞中 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ

11、的轉化，減少EGFP-LC3聚集光斑陽性的細胞數(shù)目。
　　5、小鼠受精卵胞漿顯微注射5’FAM修飾的miR-291a-5p inhibitor，熒光顯微鏡下miR-291a-5p inhibitor均勻分布于胚胎胞漿，且隨著胚胎分裂而進一步分布于各個卵裂球中，至注射后48 h觀察，仍可見綠色熒光。注射miR-291a-5p inhibitor后，胚胎中 miR-291a-5p表達顯著低于各對照組，Becn1 mRNA表達顯著高于各

12、對照組，Atg5 mRNA表達顯著高于Scramble inhibitor對照組。胚胎在1-cell階段向2-cell階段的發(fā)育率均高于各對照組，在4.5dpc的囊胚形成率顯著高于Control對照組。
　　結論：
　　1、miR-291a/b-5p作為mir-290簇的成熟microRNA分子，在小鼠著床前胚胎中的表達呈動態(tài)變化，其表達趨勢在小鼠胚胎2~4-cell發(fā)育階段與自噬相關基因 Atg5和Becn1 mRNA呈反