沙眼衣原體呼吸道感染小鼠肺組織γδT細(xì)胞及其亞群的增殖、活化和功能研究.pdf

1、目的：
　　γδT細(xì)胞是宿主固有免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，它橋聯(lián)固有免疫和適應(yīng)性免疫，在抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和維持免疫耐受等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。本研究用沙眼衣原體小鼠肺炎菌株（Chlamydia muridarum,Cm）經(jīng)呼吸道感染誘導(dǎo)小鼠沙眼衣原體肺炎。首先探討Cm呼吸道感染誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞在感染肺組織的增殖、活化及功能。其次我們探討小鼠肺組織γδT細(xì)胞亞群的組成及其Cm感染后發(fā)生的變化；進(jìn)一步探討主要的γδT細(xì)胞亞群

2、Vγ1+T和Vγ4+T細(xì)胞在沙眼衣原體呼吸道感染后的增殖、活化及分泌細(xì)胞因子IL-17和IFNγ的能力，從而明確γδT細(xì)胞及其亞群在小鼠衣原體肺炎中的作用，為胞內(nèi)菌感染免疫學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　WT小鼠（C57BL/6鼠）經(jīng)鼻腔吸入1×103 IFU（衣原體包涵體形成單位）的沙眼衣原體小鼠肺炎菌株（Cm），建立小鼠沙眼衣原體肺炎模型。
　　1.分離感染后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織單個(gè)核細(xì)胞，用熒光標(biāo)記的抗鼠C

3、D3、TCRγδ及CD69抗體染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織CD3+TCRγδ+T細(xì)胞的百分率、CD69的表達(dá)水平，利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞IFNγ和IL-17的分泌，明確Cm感染誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的增殖活化和功能。
　　2.用Cm呼吸道感染W(wǎng)T小鼠和TCRδ-/-小鼠，每天監(jiān)測(cè)小鼠的一般狀況和體重變化，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)小鼠肺組織衣原體包涵體形成單位（IFU），肺組織病理切片行H&E染色觀察兩種小鼠肺組織炎癥，明確γδ

4、T細(xì)胞在衣原體肺炎中的作用。
　　3.取健康小鼠及Cm感染后不同時(shí)間點(diǎn)的肺組織，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織γδT細(xì)胞各亞群mRNA的表達(dá)，探討γδT細(xì)胞亞群在小鼠肺組織的分布及Cm感染后的變化。
　　4.取Cm感染后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織單個(gè)核細(xì)胞，用熒光標(biāo)記的抗鼠CD3、TCRγδ、TCRVγ1和TCRVγ4抗體染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞占γδT細(xì)胞的百分比及其細(xì)胞數(shù)，用抗鼠CD69抗體檢測(cè)

5、Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞CD69的表達(dá)，探討兩種γδT細(xì)胞亞群的增殖和活化；利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)分別測(cè)定Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞分泌IFNγ和IL-17的水平，探討小鼠肺組織γδT細(xì)胞亞群在Cm感染中分泌細(xì)胞因子的能力。
　　結(jié)果：
　　一定劑量的Cm經(jīng)呼吸道感染誘導(dǎo)小鼠沙眼衣原體肺炎。與未感染組比較， Cm感染誘導(dǎo)小鼠肺γδT細(xì)胞百分率及細(xì)胞數(shù)逐漸升高，于感染后第7天達(dá)到高峰（p<0.01）；Cm感染可誘導(dǎo)肺γδ

6、T細(xì)胞活化，CD69表達(dá)于感染后第3天及第7天水平顯著增高（p<0.01，p<0.05）。Cm感染誘導(dǎo)γδT細(xì)胞在感染早期（前3天）分泌大量IFNγ和IL-17參與宿主抗衣原體免疫應(yīng)答。TCRδ-/-小鼠在感染Cm后，表現(xiàn)出比WT小鼠更嚴(yán)重的疾病體征，說(shuō)明γδT細(xì)胞在沙眼衣原體感染中發(fā)揮一定的免疫保護(hù)作用。根據(jù)TCRγ鏈的不同，小鼠γδT細(xì)胞分為Vγ1+T、Vγ2+T、Vγ4+T、Vγ5+T、Vγ6+T、Vγ7+T6個(gè)γδT細(xì)胞亞群，其

7、組織分布尚無(wú)確切結(jié)論。我們首先對(duì)γδT細(xì)胞亞群在健康小鼠肺組織的分布進(jìn)行了研究，RT-PCR結(jié)果顯示，小鼠肺組織存在Vγ1+T、Vγ2+T、Vγ4+T、Vγ5+T、Vγ6+T5種γδT細(xì)胞亞群，其含量Vγ2> Vγ4> Vγ1> Vγ6> Vγ5。在Cm感染后，肺Vγ4+T和Vγ1+T細(xì)胞含量顯著增高，Vγ4+T細(xì)胞在第3天達(dá)高峰（p<0.001），Vγ1+T細(xì)胞在第7天達(dá)高峰（p<0.001）。Vγ6+T細(xì)胞含量也在感染后有所增加，在

8、第7天升高顯著（p<0.01），Vγ2+T細(xì)胞和Vγ5+T細(xì)胞在感染后無(wú)顯著變化。用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)肺組織Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞占γδT細(xì)胞的百分率及細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果顯示Cm感染可誘導(dǎo)肺Vγ1+T細(xì)胞百分率及細(xì)胞數(shù)逐漸升高，于感染后第7天達(dá)到高峰（p<0.01），之后下降，Vγ4+T細(xì)胞百分比和細(xì)胞數(shù)在感染后迅速升高，第3天達(dá)高峰（p<0.001），隨后下降；活化分子CD69的表達(dá)結(jié)果顯示Vγ1+T細(xì)胞在感染后第7天活化百分比最高

9、（p<0.01），Vγ4+T細(xì)胞在第3天最高（p<0.01）；結(jié)合Vγ1-Vγ4-γδT細(xì)胞占肺總γδT細(xì)胞的比例，提示Cm感染在早期主要誘導(dǎo)Vγ4+T細(xì)胞增殖，感染中后期，Vγ1+T細(xì)胞成為增殖的主要γδT細(xì)胞亞群。對(duì)于以上兩群細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的研究顯示，Vγ1+T細(xì)胞在Cm感染后可分泌IFNγ但不分泌IL-17，Cm感染誘導(dǎo)的IFNγ產(chǎn)生在感染第7天達(dá)高峰（p<0.01）；而Vγ4+T細(xì)胞于感染后可同時(shí)分泌大量IFNγ和IL-17，

10、Cm感染后其細(xì)胞因子分泌水平迅速升高，于感染后第3天達(dá)高峰（p<0.001），之后下降，至感染中期降至基礎(chǔ)水平，結(jié)果表明Vγ4+T是γδT細(xì)胞在衣原體感染早期分泌IFNγ和IL-17參與免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞亞群。
　　結(jié)論：
　　沙眼衣原體呼吸道感染可誘導(dǎo)小鼠肺組織γδT細(xì)胞的增殖、活化并在感染早期分泌大量細(xì)胞因子IFNγ和IL-17，在Cm呼吸道感染中發(fā)揮免疫保護(hù)作用。小鼠正常肺組織中存在5種γδT細(xì)胞亞群：Vγ1+T、Vγ