沙眼衣原體CT703蛋白在感染細(xì)胞中的表達(dá)及功能初探.pdf

1、一、研究目的：
　　 1.研究CT703蛋白在沙眼衣原體感染細(xì)胞中的表達(dá)模式、持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703蛋白的表達(dá)變化。
　　 2.研究CT703蛋白對Raf/MEK/ERK信號通路的激活及抗凋亡作用。
　　 二、研究方法：
　　 1.RT-PCR法擴(kuò)增沙眼衣原體L2血清型CT703基因全長序列并亞克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1中。
　　 2.IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CT70

2、3在大腸桿菌BL21中表達(dá)相應(yīng)的重組融合蛋白，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并純化重組融合蛋白，以純化的重組融合蛋白作為免疫原免疫小鼠制備抗CT703蛋白多克隆抗體。
　　 3.采用Western Blot和免疫熒光技術(shù)，以抗CT703蛋白多克隆抗體為一抗檢測CT703蛋白在沙眼衣原體急性感染狀態(tài)下的表達(dá)模式。
　　 4.采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)分別檢測在干擾素-γ誘導(dǎo)沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)下

3、CT703mRNA和蛋白水平表達(dá)變化。
　　 5.構(gòu)建CT703基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA4/CT703并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，Western Blot技術(shù)檢測CT703蛋白是否活化Raf/MEK/ERK信號通路；并檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞在十字孢堿(Staurosporine，STS)作用下，細(xì)胞凋亡率以及Caspase-3活性變化。
　　 三、研究結(jié)果：
　　 1.利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增沙眼衣原體L2血清型CT703基

4、因，擴(kuò)增片段長度約1.5kb，與預(yù)期理論值大小一致。重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CT703經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，約在1.5kb處同樣出現(xiàn)特異性DNA條帶。通過DNA測序，證實(shí)插入的基因序列與GenBank公布的CT703基因序列完全一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2.原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CT703經(jīng)IPTG在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，純化產(chǎn)物經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色顯示產(chǎn)物分子量約81kDa，由55KDa

5、的CT703蛋白和26KDa的GST蛋白組成，與預(yù)期理論的分子量大小一致。以抗GST蛋白抗體為一抗，Western Blot技術(shù)檢測純化的重組融合蛋白，在81KDa處檢測到相應(yīng)的蛋白條帶。WersternBlot實(shí)驗(yàn)證實(shí)以重組融合蛋白免疫小鼠制備的抗血清能與CT703蛋白特異性結(jié)合；間接ELISA法檢測抗血清效價(jià)，結(jié)果顯示抗體滴度最高達(dá)到1:32000。
　　 3.利用Western Blot技術(shù)檢測CT703蛋白在沙眼衣原體急

6、性感染狀態(tài)下的表達(dá)，感染后24小時(shí)可檢測到相應(yīng)的蛋白，隨著感染時(shí)間的延長，蛋白表達(dá)量逐漸增多，并持續(xù)存在于整個(gè)感染過程，未感染細(xì)胞組沒有檢測到CT703蛋白的表達(dá)；通過免疫熒光技術(shù)檢測CT703蛋白表達(dá)，最早在感染12小時(shí)即可檢測到相應(yīng)的蛋白。在干擾素-γ誘導(dǎo)沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)下，RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測CT703 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703 mRNA和蛋白表達(dá)不呈時(shí)間依賴性

7、，相同時(shí)間點(diǎn)沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703 mRNA和蛋白水平明顯低于急性感染狀態(tài)。
　　 4.間接免疫熒光技術(shù)對內(nèi)源性的CT703蛋白進(jìn)行定位，結(jié)果顯示沙眼衣原體感染細(xì)胞CT703蛋白的熒光染色部位既不同于胞漿蛋白CPAF，也不同于包涵體膜蛋白CT813。
　　 5.構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA4/CT703經(jīng)PCR、雙酶切實(shí)驗(yàn)證實(shí)插入片段大小與CT703基因片段大小一致，測序證實(shí)插入的基因序列與GenBan

8、k公布的CT703基因序列完全一致。重組質(zhì)粒pcDNA4/CT703轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞后，Western Blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)均能檢測到CT703蛋白的表達(dá)。
　　 6.真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA4/CT703轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后36小時(shí)檢測磷酸化的Raf、ERK，發(fā)現(xiàn)二者均未被磷酸化；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒36小時(shí)后，STS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡5小時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率以及用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3活性。同時(shí)設(shè)

9、STS誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞組、STS誘導(dǎo)的沙眼衣原體感染組和正常HeLa細(xì)胞組作為對照，發(fā)現(xiàn)4組細(xì)胞的凋亡率分別為：(93.1±2.01)％、(91.3±1.67)％、(3.21±0.87)％、(2.08±0.76)％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，STS誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與正常HeLa細(xì)胞組比較有顯著性差異，與STS誘導(dǎo)的衣原體感染組比較有顯著性差異(P<0.05)，與STS誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞組比較沒有顯著性差異(P>0.05)。Caspase-3活性

10、檢測結(jié)果與細(xì)胞凋亡率一致。
　　 四、結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CT703以及真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA4/CT703。
　　 2.沙眼衣原體急性感染狀態(tài)下CT703蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703蛋白表達(dá)不呈時(shí)間依賴性；相同時(shí)間點(diǎn)沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703蛋白表達(dá)明顯低于急性感染狀態(tài)。
　　 3.CT703蛋白不能激活Raf/MEK/ER