端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白的分離純化及hpot1外顯子14突變分析.pdf

1、【目的】 建立一種新的人端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白分離純化和鑒定的方法，并嘗試從人類HeLa細胞中鑒定出新的人端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白；對臨床腫瘤組織標本的人端粒保護蛋白(human protection of telomeres 1,hPOT1)基因外顯子14突變位點進行突變分析。 【方法】 1．新的人類端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白分離純化和鑒定的方法的建立 從培養(yǎng)的HeLa細胞核中分離得到核蛋白，設(shè)計(T

2、TAGGG)<,5>模擬一段端粒單鏈DNA結(jié)構(gòu)，端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白與這段探針序列能特異的結(jié)合，采用生物素一鏈霉素磁珠法分離純化核蛋白得到部分純化的端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白，通過EMSA(電泳遷移率改變分析)檢測純化效果；通過SDS-PAGE進一步分離純化部分純化的端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白，考馬斯亮蘭染色顯示蛋白帶，進而對每個蛋白帶進行膠內(nèi)酶切聯(lián)合飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)分析得到肽譜，并鑒定出新的人端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白。

3、2．hPOT1基因外顯子14突變位點分析 收集各種臨床腫瘤標本，提取基因組DNA，PCR擴增hpot1外顯子14序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，柱純化后進行DNA測序，將測序結(jié)果與野生型外顯子14序列對比，鑒定出基因突變標本。 【結(jié)果】 采用先溶脹細胞分離細胞核、再通過皺縮裂解細胞核方案，能迅速高效的分離得到總核蛋白；生物素一鏈霉素磁珠法能有效地純化人粒單鏈DNA結(jié)合蛋白，得到部分純化的端粒單鏈DNA

4、結(jié)合蛋白；部分純化的端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白經(jīng)EMSA檢測能清晰的顯示出滯后帶(端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白帶)；試圖通過SDS-PAGE進一步分離純化部分純化的端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白，僅能顯示出較弱的考馬斯亮蘭染色蛋白帶，未能達到進行膠內(nèi)酶切聯(lián)合飛行飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)分析要求，故未能鑒定出新的端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白，因此，該方案有待改進。本課題組自行設(shè)計的hpot1外顯子14引物，能從臨床各種腫瘤標本通過 PCR擴增出清晰的目的片段