碳納米角-膠原復合基質(zhì)材料對新生大鼠心肌細胞閏盤相關蛋白表達及功能成熟的影響.pdf

1、隨著心血管疾病發(fā)病率的逐年上升，特別是終末期心臟疾病患者的增加，現(xiàn)有的治療手段愈發(fā)顯現(xiàn)出局限性。針對終末期心臟疾病，現(xiàn)有的治療方式主要是藥物治療、介入治療，以及心臟移植。但是，藥物治療以及心臟介入治療只能在一定程度上緩解相應的癥狀，并不能從根本上解決或者逆轉(zhuǎn)心臟功能。心臟移植能使受損的心功能得到糾正，但是心臟移植由于存在供體不足，免疫排斥以及其他問題等而使其尚不是一種普遍的治療方式?；诖耍陙?，隨著科技的發(fā)展，一種新的治療方式—心肌

2、組織工程開始迅速發(fā)展，有望成為未來心臟疾病的有效治療方式。
　　目的：通過冰浴超聲的方法，構建碳納米角/膠原(Carbonnanohorn/Collagen,CNH/Col)的復合基質(zhì)材料，篩選出適宜于新生大鼠心肌細胞(Neonatalratventricularmyocytes，NRVMs)生長和心肌細胞分化的CNH/Col復合支架材料；體外研究基于CNH/Col復合基質(zhì)材料對NRVMs粘附、增殖、分化及功能成熟的影響，以及CN

3、H/Col復合基質(zhì)材料對心臟成纖維細胞(Cardiacfibroblast，CF)增殖活性的影響，評估碳納米角(Carbonnanohorns,CNH)在心肌組織工程(Cardiactissueengineering，CTE)中的應用前景。
　　方法：通過冰浴超聲的方法構建CNH/Col復合基質(zhì)；通過透射電鏡(Transmissionelectronmicroscopy，TEM)、原子力顯微鏡(Atomicforcemicrosc

4、ope，AFM)、電化學工作站等表征CNH/Col復合材料特性；采用胰酶消化法獲取原代NRVMs細胞,采用Live/Dead染色、CCK-8法評估CNH/Col復合材料的生物相容性，篩選出毒性最小的濃度組作為實驗濃度；通過免疫熒光染色、Westernblotting等方法評估基于CNH/Col復合基質(zhì)體外培養(yǎng)的NRVMs細胞電學蛋白connexin-43(Cx-43)及力學蛋白N-cadherin(NC)在不同時間點(3d，7d)的表達

5、、分布等情況；通過細胞內(nèi)自發(fā)鈣瞬變檢測評估基于CNH/Col復合基質(zhì)體外培養(yǎng)的NRVMs細胞在不同時間點(3d，7d)的鈣離子流差異，評估體外培養(yǎng)的心肌細胞的功能成熟程度；通過差速貼壁的方法，獲取CF，通過BrdU染色法及CCK-8法評估CNH/Col復合基質(zhì)材料對體外培養(yǎng)的CF增殖作用的影響。
　　結果：TEM結果顯示經(jīng)過冰浴超聲后，CNH能夠很好的分散在膠原中，膠原分子包繞在CNH周圍，CNH與膠原具有良好的親和力；AFM顯示

6、摻入CNH后，CNH/Col復合材料組與膠原對照組相比，表面粗糙度明顯增加；電化學工作站測量顯示CNH濃度與復合材料的電導率、電容呈正相關，摻入CNH后明顯增強了支架材料的導電性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；通過胰酶消化法，得到原代NRVMs細胞，Live/Dead染色以及CCK-8法的結果顯示0.05mg/ml及0.1mg/ml兩個濃度CNH/Col組復合基質(zhì)材料的細胞毒性低，具有良好的生物相容性；免疫熒光染色結果顯示：與膠原

7、對照組相比，在第3天和第7天兩個時間點，在CNH/Col組接種的NRVMs細胞電學蛋白及力學蛋白(Cx-43和NC)的分布面積更廣，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)第7天后，CNH/Col組Cx-43和NC蛋白呈現(xiàn)極化趨勢，特別是Cx-43蛋白在細胞間區(qū)域呈現(xiàn)出明顯的線性分布；Westernblotting結果顯示：培養(yǎng)3天后，0.1mg/mlCNH-Col組NC蛋白表達量高于0.05mg/mlCNH-Col組和膠原對照組，差異具有統(tǒng)計學意

8、義(P<0.001)，但是在第3天時間點，各組間Cx-43蛋白表達量無統(tǒng)計學差異；培養(yǎng)7天后，Cx-43蛋白在0.1mg/ml及0.05mg/mlCNH組均高于膠原對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；NC蛋白在0.1mg/ml及0.05mg/mlCNH組均高于膠原對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001,P<0.05)；細胞內(nèi)自發(fā)性鈣瞬變檢測結果顯示：培養(yǎng)5天后，0.05mg/ml和0.1mg/mlCNH/Col組Ca2+的釋

9、放頻率及幅度均大于膠原對照組，培養(yǎng)7天后膠原對照組Ca2+釋放呈微弱的無規(guī)則的電流形式，而0.05mg/ml和0.1mg/mlCNH/Col組呈現(xiàn)出顯著的節(jié)律性，表現(xiàn)為一致性收縮，并且鈣釋放的幅度更明顯；BrdU染色結果顯示：第1天，各組間CFs增殖情況結果沒有統(tǒng)計學差異；第3天，與膠原對照組相比，0.1mg/mlCNH-Col組CFs細胞BrdU陽性率小于10％，CFs細胞增殖受到顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；第7天

10、，與膠原對照組相比，0.1mg/ml及0.05mg/mlCNH-Col組CFs細胞BrdU陽性率小于5%,CFs細胞增殖受到顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；CCK-8實驗結果顯示：第1天，0.1mg/mlCNH-Col組吸光度大于膠原對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第3天，0.1mg/mlCNH-Col組吸光度小于膠原對照組及0.05mg/mlCNH組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；第7天，0.1