納米材料作為心肌細胞siRNA遞送載體及對閏盤組裝發(fā)育影響的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
 ?。ㄒ唬┩ㄟ^體外及體內(nèi)研究驗證基于單壁碳納米管(SWNTs)的siRNA載體沉默Caspase3對急性梗死(AMI)早期細胞凋亡及心功能的影響;
  (二)評估納米金顆粒(AuNP)/膠原(Col)復(fù)合材料對新生大鼠心肌細胞(NRVM)閏盤(ID)組裝及功能成熟的影響,并探討AuNPs調(diào)控ID組裝的分子機制。
  方法:
  (一)構(gòu)建SWNTs與siRNA復(fù)合載體F-CNT-siCas3,通過west

2、ern blotting、RT-PCR等評估其對體外培養(yǎng)NRVM目的基因表達的影響;通過超聲,Tunel染色等評估其對AMI大鼠早期凋亡、心功能的影響;
 ?。ǘ┎捎迷恿︼@微鏡(AFM)、透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)、電化學(xué)工作站等表征AuNP/Col復(fù)合材料特性;采用live-dead、阿爾瑪藍染色等評估復(fù)合材料的生物相容性;從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及功能上分別評估各組心肌細胞ID相關(guān)蛋白在不同時間點(3d、7d、14

3、d)的表達、分布及組裝情況;采用免疫熒光染色、western blotting、RT-PCR等方法探究β1-整合素信號通路在AuNPs調(diào)控ID成熟及功能發(fā)揮中的作用。
  結(jié)果:
  (一)western blotting、RT-PCR結(jié)果表明與對照組相比,F(xiàn)-CNT-siCas3降低了NRVM的Caspase3表達;超聲,Tunel染色等結(jié)果表明F-CNT-siCas3可減輕AMI大鼠早期細胞凋亡,改善心功能;
  

4、(二)SEM檢測結(jié)果表明低濃度AuNP在Col溶液中分散更為均勻;AFM檢測表明材料的粗糙度隨AuNPs濃度的增加而增加;電化學(xué)工作站檢測顯示AuNPs濃度與復(fù)合基質(zhì)的電阻抗呈負相關(guān);Live/Dead染色及阿爾瑪藍染色結(jié)果提示:當(dāng)AuNPs濃度為0.1 mmol/L時材料對細胞活力的影響最小且有較好的促細胞增殖作用;TEM、及western blotting結(jié)果表明:AuNP/Col組NRVM細胞在各時間點的伸展、肌節(jié)發(fā)育情況均明顯優(yōu)

5、于Col組,且AuNPs可顯著增強ID相關(guān)蛋白(Cx43、PKP2、PG和N-cadherin)的表達,尤其加速縫隙連接蛋白Cx43蛋白的極化;鈣瞬變結(jié)果顯示AuNPs/Col組Ca2+的釋放節(jié)律性更顯著,并形成更大幅度的一致性收縮;β1-整合素阻斷實驗表明β1-整合素抗體同時阻斷了縫隙連接蛋白Cx43和力學(xué)連接蛋白N-cadherin的表達。western blotting檢測兩組細胞3、7和14d時的p-FAK、Src和ILK的蛋白

6、表達情況,結(jié)果表明實驗組ILK在各個時間點的表達量均顯著高于對照組。進一步通過Western blotting檢測兩組心肌細胞不同時間點p-AKT等蛋白表達情況,結(jié)果表明實驗組p-AKT在各個時間點的表達量均顯著高于對照組,而其余蛋白無明顯變化;p-AKT信號通路阻斷實驗顯示,與對照組相比,呈線性斑塊分布于心肌細胞間區(qū)域的Cx43蛋白顯著減少。相反,添加β-catenin的信號阻斷劑IWP-2后,未抑制Cx43蛋白的表達及分布。而添加這

7、兩種阻斷劑對心肌細胞間N-cadherin表達無影響。
  結(jié)論:
 ?。ㄒ唬┗赟WNTs的F-CNT-siCas3載體有效沉默了Caspase3表達,并可減少AMI大鼠早期細胞凋亡,改善心功能,為CNTs用于心肌基因治療提供了新的思路;
  (二)AuNP/Col復(fù)合基質(zhì)具有良好的生物相容性,且基于AuNPs的膠原復(fù)合基質(zhì)可促進NRVM中ID的形成、組裝和功能成熟。β1-整合素/ILK/p-AKT信號通路在AuNP

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