Calpains介導心肌細胞閏盤重塑.pdf

1、【研究背景】
　　心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是威脅人類健康的頭號殺手。心肌重塑在心臟從代償階段向失代償階段即心力衰竭（heart failure，HF）轉化中扮演重要角色，所以對于心肌重塑的干預一直是臨床治療心肌疾病和基礎研究心衰發(fā)生機制的重點。閏盤是心肌細胞間的重要連接結構和代謝活躍區(qū)域，也是新生肌節(jié)加入的地方。閏盤重塑在心肌重塑過程中起重要作用，然而，參與閏盤重塑的蛋白及其調節(jié)因素還不清

2、楚。由于在多種心肌疾病中，心肌細胞內都會出現鈣超載現象。鈣蛋白酶calpains是鈣依賴性蛋白水解酶，calpastatin是其內源性抑制劑，參與Ca2+介導的細胞內生理或病理生理過程。本實驗室前期的研究發(fā)現 calpain-2和 calpastatin在心肌閏盤處大量分布，尚無 calpain-2和 calpastatin在閏盤處作用的相關研究。因此，本實驗利用尾部懸吊4周模擬失重大鼠模型（4-week of tail-suspend

3、ed rats，SUS）、離體心肌局部缺血再灌注損傷模型（ischemia-reperfusion injury，I-R）、腹主動脈縮窄（transverse abdominal aortic constriction，TAC）高血壓心肌肥厚模型等不同心臟重塑模型，比較calpain-2和 calpastatin在不同閏盤重塑過程中的異同點，認為 calpains可能通過調節(jié)鈣黏蛋白 N-cadherin參與維持閏盤正常結構和新生肌節(jié)的

4、加入，在閏盤重塑中起重要的降解老蛋白質和維持新蛋白質合成環(huán)境的作用。
　　【研究目的】
　?。?）觀察calpain-2和calpastatin在心肌閏盤上的定位
　　（2）比較對照組（CON）、SUS組、I-R組和TAC組閏盤處calpain-2和calpastatin的分布
　?。?）觀察閏盤在CON組、SUS組、I-R組和TAC組中心臟重塑過程中的變化
　?。?）探索calpains在閏盤重塑中的作用

5、及其底物
　　【研究方法】
　　本實驗采用免疫組織化學、免疫熒光、包埋前免疫電鏡和包埋后免疫電鏡等多種方法，驗證calpain-2和calpastatin在心肌細胞內的表達及定位；心肌組織冰凍切片和膠原酶消化的單個心肌細胞分別進行免疫標記，采用激光掃描共聚焦顯微成像技術，觀察 calpain-2和calpastatin在心肌組織和單個心肌細胞中的表達和定位；采用尾部懸吊4周模擬失重大鼠模型、大鼠離體局部心肌缺血再灌注損傷模型

6、和腹主動脈縮窄高血壓大鼠心肌肥厚模型構建不同的病理情況下心肌重塑模型；用透射電子顯微鏡技術，觀察心肌重塑過程中心肌肌原纖維和閏盤的超微結構變化；利用體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞的方法，通過Ca2+載體A23187提高細胞內游離Ca2+濃度來激活calpain，或使用calpain特異性抑制劑PD150606來抑制calpain的活性；使用calpain GloTM Protease Assay檢測試劑盒熒光素酶生物發(fā)光法檢測細胞內calpa

7、in活性的變化，以證實培養(yǎng)的心肌細胞內 calpain的活性受到A23187或PD150606的調節(jié)；最后用細胞免疫熒光和激光共聚焦顯微成像技術，觀察N-cadherin和CX-43的表達分布情況。
　　【研究結果】
　?。?）心肌細胞的閏盤有calpain-2和calpastatin等多種蛋白質的分布。
　　免疫組織化學和細胞免疫熒光結果顯示 calpain-2在心肌細胞中呈橫紋狀分布，且在閏盤處有中等量的聚集。用閏

8、盤結構蛋白N-cadherin、CX-43標記閏盤位置，與calpastatin進行免疫雙重標記結果顯示 calpastatin在心肌細胞中散在分布，在閏盤處大量聚集。包埋前免疫電鏡和包埋后免疫電鏡進一步確定了 calpain-2和calpasatatin在心肌超微結構中的定位，calpain-2主要集中在 Z盤和閏盤分布，故在免疫組化和免疫熒光圖像中呈橫紋狀；calpastatin在整個心肌細胞內都有分布，閏盤大量分布，在超微結構上的

9、分布無明顯特征，與免疫熒光結果一致。
　?。?）Calpastatin在 SUS大鼠重塑心臟中未發(fā)生明顯變化，calpain-2在 SUS大鼠心臟中明顯向心肌細胞核轉位。
　　尾部懸吊4周模擬失重大鼠誘導心臟重塑，SUS組與CON組相比，比目魚肌萎縮明顯，但心臟體重比未見明顯變化。Western blot檢測calpain-2與calpastatin的表達量，SUS組與CON組之間未見明顯差異；免疫熒光顯示calpain-2

10、和calpastatin在閏盤處的分布亦未見明顯差異，calpain-2在SUS組有明顯向細胞核轉位的現象，可能與SUS組心肌細胞凋亡易感性增加有關。
　?。?）Calpastatin和 N-cadherin在離體局部缺血再灌注損傷心臟梗死區(qū)表達明顯降低。
　　大鼠離體局部心肌缺血再灌注損傷心臟中，利用CX-43和p-CX-43在梗死區(qū)表達降低，在正常區(qū)域內表達正常的特點來定位心肌缺血再灌注損傷邊緣區(qū)域。在損傷邊緣區(qū)，靠近梗

11、死區(qū)域的一側calpastatin表達明顯降低，尤其是閏盤處的分布特征完全消失，在靠近正常區(qū)域的一側，calpastatin的表達和分布與正常對照組相似，無明顯變化。在梗死區(qū)域內，N-cadherin的表達明顯降低。透射電子顯微鏡觀察損傷邊緣區(qū)域閏盤的變化，發(fā)現正常心肌細胞中，末端肌節(jié)的肌絲與閏盤緊密相連，死亡的心肌細胞末端肌節(jié)與閏盤邊緣的距離明顯增加，肌絲與閏盤之間的連接斷裂導致肌節(jié)攣縮和細胞死亡。
　　（4）TAC大鼠心臟閏盤

12、重塑明顯，calpain-2在閏盤處的分布明顯增加。
　　腹主動脈縮窄高血壓誘導心肌肥厚模型中，透射電鏡顯示TAC心肌閏盤重塑明顯，4 h后即可見到大量增寬的閏盤，和新生肌節(jié)的加入；在12周之后，閏盤重塑持續(xù)存在。免疫組織化學染色顯示calpain-2在TAC心肌閏盤上的分布明顯多于CON組，calpastatin在心肌閏盤處的分布未見明顯變化。
　?。?）Calpains被激活后，培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞中N-cadherin

13、表達明顯降低。
　　在體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞中，利用Ca2+載體A23187提高細胞內游離Ca2+濃度后，檢測發(fā)現細胞內 calpain的活性明顯增加，calpain抑制劑PD150606可明顯降低A23187的這一效應。Calpain被激活后，可見培養(yǎng)心肌細胞內新生肌原纖維裝配量明顯降低，N-cadherin的表達量明顯減少，但是CX-43的表達及分布未見明顯變化。PD150606可明顯抑制N-cadherin的降解。

14、>　　【研究結論】
　　本研究采用免疫組織化學、免疫熒光、免疫電子顯微鏡技術從多個層面驗證了calpain-2和 calpastatin在心肌細胞內的分布，證實了calpain-2和calpastatin在閏盤處的定位；通過建立尾部懸吊模擬失重大鼠、離體心臟局部缺血再灌注損傷和腹主動脈縮窄高血壓心肌肥厚等模型，觀察不同心肌重塑過程中閏盤的重塑特點，發(fā)現在肥大心肌細胞生長過程中，閏盤是新生肌節(jié)加入的地方，并且calpain和calp