早期缺氧對大鼠心肌細(xì)胞AMPK的影響及PHIs激活大鼠心肌細(xì)胞中AMPK的信號途徑研究.pdf

1、細(xì)胞缺氧是許多疾病條件下最常見的病理生理現(xiàn)象之一，是導(dǎo)致燒＼創(chuàng)傷后組織臟器損害的重要因素。能量代謝障礙是缺氧導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損害的根本原因。在缺氧早期，心肌細(xì)胞即啟動內(nèi)源性能量保護機制以增強細(xì)胞對缺氧損害的耐受，這對于有機體的存活起到?jīng)Q定性的作用。 腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinaseAMPK)是細(xì)胞能量狀態(tài)的中心感受器和調(diào)節(jié)器。一旦被激活，AMPK會通過直接磷酸化下游調(diào)節(jié)蛋白或間接影響基因

2、表達(dá)等方式，抑制消耗ATP的能量消耗途徑(如抑制脂肪合成，膽固醇合成，蛋白合成等)，并激活A(yù)TP的能量產(chǎn)生途徑(如增加糖酵解、葡萄糖攝取、抑制，促使線粒體酶活性增加及線粒體增生，使氧化磷酸化效率提高等)來阻止細(xì)胞內(nèi)ATP的進(jìn)一步消耗，從而產(chǎn)生能量保護效應(yīng)，提高細(xì)胞的抗缺氧能力，在維持缺氧細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中扮演關(guān)鍵角色。AMPK有兩種激活方式，除了被細(xì)胞內(nèi)增多的AMP變構(gòu)激活外，被其上游激酶(AMPKKinase)磷酸化激活是

3、更為重要且必不可少的激活方式。 脯氨酸羥化酶(prolylhydroxylasedomain-containingproteins，PHDs)是近年發(fā)現(xiàn)的重要缺氧感受器，使用PHD抑制劑(PHI)抑制PHD會誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的缺氧保護性反應(yīng)。 結(jié)合這些研究進(jìn)展，我們提出假設(shè)： 1.在缺氧早期，心肌細(xì)胞中AMPK的活化很可能先于AMP/ATP比率升高，在尚未出現(xiàn)明顯的能量代謝障礙之前即啟動內(nèi)源性能量保護機制。

4、 2.缺氧信號有可能通過缺氧感受器脯氨酸羥化酶(PHDs)經(jīng)AMPKK途徑激活A(yù)MPK，由此，使用PHD的抑制劑(PHI)激活PHD級聯(lián)也極有可能在不產(chǎn)生明顯干擾的前提下激活心肌細(xì)胞中AMPKK-AMPK途徑。目前早期缺氧對心肌細(xì)胞中AMPK級聯(lián)的活化途徑尚不明確，激活PHD途徑對AMPK級聯(lián)的影響國內(nèi)外尚未見報道。 本研究擬在離體原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞模型上，應(yīng)用HPLC、westernblot，體外激酶反應(yīng)等現(xiàn)代分子生物學(xué)

5、的方法，探討缺氧早期心肌細(xì)胞內(nèi)AMPK途徑活化的方式，從PHI入手了解其對常氧心肌細(xì)胞中AMPK途徑活化的影響及其在改善缺氧心肌細(xì)胞能量狀態(tài)、影響心肌細(xì)胞抗缺氧能力方面的作用，并探討PHI激活A(yù)MPK的分子機制，目的在于證明心肌細(xì)胞中PHI-AMPKK-AMPK途徑的存在并探討其作用機制。力圖從全新的角度探討缺氧條件下心肌細(xì)胞的內(nèi)源性能量保護的發(fā)生機制與上游調(diào)控環(huán)節(jié)。從而為臨床防治心肌缺血缺氧性損害提供新的手段和理論依據(jù)。 材料

6、方法： 1.建立大鼠原代心肌細(xì)胞缺氧模型，應(yīng)用高效液相色譜檢測心肌細(xì)胞中能量狀態(tài)的變化，Westernblot檢測心肌細(xì)胞中的AMPK、ACC的蛋白含量以及各自磷酸化程度的變化；通過制作原核表達(dá)的AMPKα11-312蛋白并進(jìn)行體外激酶反應(yīng)進(jìn)一步證明早期缺氧激活心肌細(xì)胞中AMPK的途徑。 2.應(yīng)用HPLC，Westernblot，心肌細(xì)胞活力測試等方法，通過在大鼠原代心肌細(xì)胞模型上觀察2種PHI對細(xì)胞內(nèi)ATP,AMP及A

7、MP/ATP比率的影響、AMPK及其下游底物ACC磷酸化蛋白含量的影響以及PHI預(yù)處理對缺氧12h心肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量和細(xì)胞活力的影響。探討2種PHI對心肌細(xì)胞種AMPK途徑的激活作用及激活途徑，觀察PHIs預(yù)處理對改善缺氧條件下大鼠心肌細(xì)胞能量狀態(tài)及活力的作用及其與PHI-AMPK途徑的相關(guān)性。 3.通過應(yīng)用激光共聚焦，Westernblot，免疫共沉淀，體外激酶反應(yīng)等方法，在體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞模型上，觀察2種PHI對心肌

8、細(xì)胞種ROS，[Ca2+]i濃度變化的影響，并應(yīng)用各種抑制劑探討心肌細(xì)胞中PHI-AMPKK-AMPK途徑的具體機制。 主要結(jié)果與結(jié)論： 1.缺氧早期(缺氧1h以內(nèi))心肌細(xì)胞中高能磷酸物質(zhì)(ATP,AMP,AMP/ATP比率)與常氧條件下相比無明顯變化。而在缺氧5min時心肌細(xì)胞中AMPK途徑活力即明顯增高，AMPK活力與p-AMPK呈顯著正相關(guān)，而與細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比率無明顯相關(guān)關(guān)系。體外激酶反應(yīng)說明缺氧早期(5-

9、15min)心肌細(xì)胞中AMPKK活力顯著增高且與AMP變構(gòu)調(diào)節(jié)無關(guān)。提示AMPKK-AMPK途徑是早期缺氧激活心肌細(xì)胞AMPK級聯(lián)的主要途徑，而非傳統(tǒng)認(rèn)為的AMP變構(gòu)激活。 2.使用PHIs處理心肌細(xì)胞可在不產(chǎn)生明顯代謝干擾的前提下通過AMPKK途徑磷酸化激活A(yù)MPK，該作用可被AMPK特異性抑制劑阻斷。用PHIs預(yù)處理可顯著增加缺氧12h心肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量和細(xì)胞生存率，且該效應(yīng)亦可被AMPK特異性抑制劑CC顯著阻斷。實驗結(jié)果

10、說明，PHIs對心肌細(xì)胞中AMPK途徑的磷酸化激活是其顯著改善缺氧細(xì)胞能量狀態(tài)、提高缺氧心肌細(xì)胞生存率的主要原因。 3.DMOG對大鼠心肌細(xì)胞ROS/RNS的產(chǎn)生沒有影響；EDHB雖然可以在大鼠心肌細(xì)胞中激活NO-mitoKATP途徑，從而增加mitoROS以及RNS的產(chǎn)生，但ROS清除劑NAC，NOS抑制劑L-NAME以及線粒體KATP通道抑制劑5-HD都不能有效阻斷EDHB誘導(dǎo)的AMPK途徑磷酸化激活。說明ROS和RNS顯然

11、都不是EDHB激活A(yù)MPK途徑的上游機制。 4.PHIs可顯著增加心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，使用鈣離子螯合劑預(yù)清除細(xì)胞中的Ca2+可阻斷PHI-AMPK途徑，而使用鈣離子誘導(dǎo)劑增加細(xì)胞中Ca2+則能模仿PHIs導(dǎo)致AMPK磷酸化增加。免疫共沉淀結(jié)果顯示，PHIs處理后心肌細(xì)胞中CaMKKa與AMPK親合力增加，提示PHIs可導(dǎo)致AMPK與CaMKK相互作用更加頻繁。使用CaMKK抑制劑可顯著阻斷PHIs對AMPK以及ACC的磷酸化激