斜帶石斑魚(yú)胃蛋白酶原和幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、斜帶石斑魚(yú)在東南亞和中國(guó)南部，是重要經(jīng)濟(jì)海水魚(yú)種之一。斜帶石斑魚(yú)具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，國(guó)內(nèi)外有不少學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究報(bào)道，但對(duì)其消化生理，尤其是消化酶的分子生物學(xué)研究，目前還沒(méi)有報(bào)道。本論文以斜帶石斑魚(yú)胃蛋白酶原和幾丁質(zhì)酶為對(duì)象，主要研究結(jié)果如下： 1、應(yīng)用CloneMiner重組技術(shù)構(gòu)建了胃組織cDNA文庫(kù)，庫(kù)容量為5.6×106 cfu/ml。隨機(jī)挑取512個(gè)克隆測(cè)序，獲得293個(gè)EST序列。其中69.97％ESTs在GenBa

2、nk蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到同源性較高的序列，這些ESTs編碼的蛋白按生物功能可分能量代謝、消化酶類、蛋白合成、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和未知功能蛋白等10種類型，包括了16條胃蛋白酶相關(guān)EST序列和68條幾丁質(zhì)酶相關(guān)EST序列。該文庫(kù)保留了胃組織分子生物學(xué)信息，為克隆胃組織中功能基因和研究斜帶石斑魚(yú)消化生理的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 2、本研究克隆的胃蛋白酶原C、A1和A2全長(zhǎng)cDNA序列分別為1485bp、1764bp和1314bp，開(kāi)放閱

3、讀框分別編碼387個(gè)、376個(gè)和377個(gè)氨基酸；信號(hào)肽預(yù)測(cè)，均在Gly16-Ile17位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)；酶原激活位點(diǎn)預(yù)測(cè)分別在Phe53-Tyr54、Tyr45-Pro46和Phe45-Pro46位點(diǎn)。胃蛋白酶原A1、A2和C基因序列均由8個(gè)長(zhǎng)度不一的內(nèi)含子和9個(gè)外顯子構(gòu)成，長(zhǎng)度分別為3.0kb、2.3kb和3.4kb。Northern blot分析表明胃蛋白酶原C、A1和A2基因分別有3個(gè)、2個(gè)和3個(gè)轉(zhuǎn)錄本。對(duì)斜帶石斑魚(yú)與魚(yú)類酸性蛋

4、白酶氨基酸序列的同源性比較和進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，胃蛋白酶原C、A1和A2基因都屬于魚(yú)類天冬酸蛋白酶中的胃蛋白酶原家族。 對(duì)胃蛋白酶原在斜帶石斑魚(yú)成體各組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況的分析結(jié)果顯示，胃蛋白酶原A1 mRNA僅在胃中表達(dá)，胃蛋白酶原A2則在胃和中腸都有表達(dá)，而胃蛋白酶原C mRNA除了在胃中，還在腸、幽門(mén)垂、食管、鰓和性腺中檢測(cè)到。本研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)魚(yú)類胃蛋白酶原C和A2 mRNA在胃以外的非酸性環(huán)境的組織中表達(dá)，提示

5、胃蛋白酶C和A2除了有分解底物中蛋白的功能外，很可能還有其它的生理功能。 胃蛋白酶原C和A2 mRNA自受精卵和出膜后1天，就可持續(xù)被檢測(cè)到表達(dá)，并在出膜后29天表達(dá)量顯著增高；胃蛋白酶原A1在出膜后29天才檢測(cè)到有mRNA表達(dá)。結(jié)果提示，胃蛋白酶原C、A1和A2按次序性表達(dá)的模式，可能與斜帶石斑魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期需要種類和數(shù)量不同的酶來(lái)消化各種食物中的蛋白有關(guān)。 3、本研究克隆的幾丁質(zhì)酶1和2 cDNA序列全長(zhǎng)分別為165

6、8bp和1764bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度分別為1434bp和1485bp，編碼477個(gè)和494個(gè)氨基酸，前21個(gè)氨基酸組成了信號(hào)肽，第22位氨基酸之后是成熟肽。氨基酸序列分析顯示這兩種基因都有典型的18家族幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)區(qū)域特征，含有g(shù)lyco-18區(qū)域、2型幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域、酶催化活性位點(diǎn)和一個(gè)鉸鏈區(qū)域。幾丁質(zhì)酶2的鉸鏈區(qū)域具有脊椎動(dòng)物酸性幾丁質(zhì)酶的特征性序列，即絲氨酸和甘氨酸(S—G)重復(fù)序列；而在幾丁質(zhì)酶1氨基酸序列中含有一段特征性的頡氨

7、酸、天冬酰胺和脯氨酸重復(fù)序列(NVNPPVNPNVNP)。對(duì)斜帶石斑魚(yú)與其它脊椎動(dòng)物幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的同源性比較和進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，斜帶石斑魚(yú)幾丁質(zhì)酶1和2分別與日本比目魚(yú)酸性幾丁質(zhì)酶1和2的同源性最高，而且都處于同一分枝上，屬于酸性幾丁質(zhì)酶大類。 4、利用表達(dá)載體pET3c—sumo建立了幾丁質(zhì)酶1和2成熟肽的原核表達(dá)系統(tǒng)，分別在大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了分子量約62.7kDa和63.8kDa的

8、含有sumo和His—tag標(biāo)簽的融合蛋白幾丁質(zhì)酶1和2，絕大部分以包涵體形式表達(dá)。通過(guò)純化包涵體，利用SUMO酶酶切去除sumo和His—tag標(biāo)簽，再經(jīng)Ni—NTA Resin親和純化分離出純度為94％的單體蛋白幾丁質(zhì)酶1或2；并作為抗原分別免疫新西蘭大白兔，抗血清經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀純化，獲得了沒(méi)有免疫交叉反應(yīng)、高特異性的兔抗幾丁質(zhì)酶1和2多克隆抗體。 5、根據(jù)幾丁質(zhì)酶1和2核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，以及應(yīng)用本研究制備的多克隆抗

9、體，利用RT—PCR和Western blot方法進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析，結(jié)果顯示幾丁質(zhì)酶1和2在不同組織中和發(fā)育時(shí)期均只有一種表達(dá)形式。幾丁質(zhì)酶1和2 mRNA在胃、中腸、脾臟和腎臟、皮膚中檢測(cè)到。但在蛋白水平，幾丁質(zhì)酶1只在胃和脾臟中有表達(dá)，而幾丁質(zhì)酶2表達(dá)僅限于胃。隨著斜帶石斑魚(yú)仔、稚、幼魚(yú)的發(fā)育，幾丁質(zhì)酶1在剛出膜即可檢測(cè)到有mRNA和蛋白低水平、持續(xù)表達(dá)，出膜后35天，mRNA表達(dá)量有所增高，而蛋白表達(dá)量到了65天才明顯上升。幾丁質(zhì)

10、酶2在出膜后第5天才檢測(cè)到有mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)，直至出膜后65天才檢測(cè)到有蛋白表達(dá)。 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在胃體部中胃腺的峽部、頸部和底部都有幾丁質(zhì)酶1和2免疫陽(yáng)性反應(yīng)，其中幾丁質(zhì)酶1在底部的免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布密度比幾丁質(zhì)酶2較高；在脾臟檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶1免疫陽(yáng)性細(xì)胞，但未檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶2免疫反應(yīng)性。 以上結(jié)果提示，幾丁質(zhì)酶1和2的表達(dá)都是翻譯水平調(diào)控，但調(diào)控機(jī)理有所不同；兩者的生理功能有異同，除了參與食物消化外，幾丁質(zhì)

11、酶1很可能還參與自身防御、免疫活動(dòng)等生理過(guò)程，在仔魚(yú)和稚魚(yú)發(fā)育階段也可能參與十分重要的生理活動(dòng)。 6、構(gòu)建了畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5k、pPICZαA和pPGAPZαA，構(gòu)建了幾丁質(zhì)酶1和2成熟肽的表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了胞內(nèi)表達(dá)重組幾丁質(zhì)酶1和2、組成型分泌表達(dá)重組幾丁質(zhì)酶1以及誘導(dǎo)型分泌表達(dá)重組幾丁質(zhì)酶2的GS115重組菌株，結(jié)果顯示畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)的重組幾丁質(zhì)酶1和2水解可溶性幾丁質(zhì)酶的酶活力分別為59.1U和56.2U；