斜帶石斑魚促性腺激素Ⅰ和Ⅱ的組織表達(dá)分布和蛋白表達(dá)研究.pdf

1、本文通過構(gòu)建GtHⅠβ亞基和GtHⅡβ亞基原核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，提供標(biāo)準(zhǔn)品及用于制備抗體，解決天然GtH蛋白難以純化的問題。同時(shí)對GtHⅠβ亞基和GtHⅡβ亞基在各組織中mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，試圖從分子水平了解斜帶石斑魚生殖生長的一些規(guī)律。主要研究內(nèi)容包括如下：1.運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)結(jié)合Southern雜交技術(shù)分析了GtHⅠβ和GtHⅡβ基因在雌性性成熟的斜帶石斑魚的12組織中的表達(dá)情況?？傮w來說GtHⅡ

2、β在各組織中的表達(dá)量明顯高于GtHⅠβ，說明GtHⅡ在魚類性腺成熟和排精排卵時(shí)期起到更重要的作用。值得注意的是，性腺在雌性性成熟的斜帶石斑魚GtHⅠβ和GtHⅡβ都具有較高的表達(dá)量。提示性腺可能也是一個(gè)促性腺激素分泌器官，調(diào)控斜帶石斑魚的生殖生理活動(dòng)。2.根據(jù)已知斜帶石斑魚GtHⅡβ亞基cDNA序列設(shè)計(jì)一對引物(GtHⅡβF/R)，以斜帶石斑魚脾臟cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，產(chǎn)物回收后連接到pGEM-Teasy載體

3、上，篩選陽性質(zhì)粒并測序得以驗(yàn)證。通過對表達(dá)菌株在不同溫度、不同IPTG濃度和不同誘導(dǎo)時(shí)間的研究發(fā)現(xiàn)，兩種菌株在37℃和25℃均能成功地表達(dá)目的蛋白。通過構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，得到表達(dá)GtHⅡβ亞基蛋白的菌株GtHⅡβ-PET22b(+)-BL21，誘導(dǎo)條件均為在0.1mMIPTG和37℃下誘導(dǎo)7小時(shí)。3.將斜帶石斑魚GtHⅠβ基因克隆于融合表達(dá)載體PET22b(+)構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒GtHⅠβ-PET22b(+)，轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)菌株BL-21(DE3)