大鼠組織G蛋白偶聯(lián)受體激酶4的表達(dá)特征及其新剪接變異體的克隆.pdf

1、目的：G蛋白偶聯(lián)受體激酶（GRK）是一類能使G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）快速脫敏（desensitization）的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族分子，其基本功能是特異性地磷酸化 GPCR，使其快速脫敏與 G蛋白解偶聯(lián)，同時(shí)招募β–Arrestin并與之結(jié)合，從而阻斷GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在哺乳動(dòng)物中GRK家族共有7個(gè)成員，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的相似性分為3個(gè)亞家族，GRK4屬于GRK4亞家族。在GRK家族中，GRK4的變異率最大，有多個(gè)剪接變異

2、體，其組織表達(dá)呈高度選擇特異性，參與多種疾病的致病機(jī)制，如原發(fā)性高血壓、多巴胺受體介導(dǎo)的神經(jīng)源性疾病、卵巢癌和乳腺癌等。目前，對(duì)于GRK4的了解知之甚少，而關(guān)于GRK4在組織器官的分布情況亦缺乏詳盡的研究。因此，筆者選取大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來研究 GRK4基因的表達(dá)特征及功能，以期為之后的深入研究奠定良好的基礎(chǔ)。
　　方法：1.大鼠組織GRK4的表達(dá)特征：1）用Trizol提取不同年齡段大鼠卵巢組織和同只大鼠主要組織總RNA，逆轉(zhuǎn)

3、錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)從RNA水平檢測GRK4的表達(dá)特征；2）用加入抑蛋白酶肽、亮抑酶酞、PMSF的 RIPA蛋白裂解液提取組織總蛋白，采用 Western免疫印跡技術(shù)從蛋白水平檢測 GRK4在不同年齡大鼠各組織中的表達(dá)情況。2. GRK4基因及其新剪接變異體的獲取和克?。焊鶕?jù)GenBank里大鼠GRK4基因序列設(shè)計(jì)特異性全長擴(kuò)增引物；根據(jù)Western blot檢測結(jié)果，用Trizol提取大鼠睪丸和附睪組織總RNA

4、，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，二次PCR擴(kuò)增出純度較高的大鼠GRK4基因及其剪接變異體DNA，電泳鑒定；回收電泳瓊脂糖凝膠中多個(gè)不同分子量的條帶，TA克隆，藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)選取陽性克隆經(jīng) PCR鑒定后，小提質(zhì)粒送測序；使用 NCBI- BLAST工具（http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）將所得序列與GenBank中己有序列進(jìn)行比對(duì)分析，使用NCBI-Spidey工具(http://www.nebi.

5、nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey)在線分析有效序列各外顯子組成及位置。
　　結(jié)果：1.大鼠組織GRK4的表達(dá)特征：1）通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測GRK4基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：①大鼠卵巢中GRK4基因的表達(dá)水平隨卵巢發(fā)育成熟而變化；②GRK4基因主要表達(dá)于大鼠卵巢、腎臟、心和骨骼肌組織。2）通過Western blot檢測GRK4蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示 GRK4在大鼠的胸腺、睪丸

6、、附睪、心和腦組織有較高表達(dá)，不同發(fā)育階段其表達(dá)情況也不同。2.使用PCR技術(shù)擴(kuò)增出大鼠GRK4基因及其新剪接變異體，TA克隆后送測序，經(jīng)過比對(duì)分析獲得2個(gè)在GRK4開放閱讀框架內(nèi)的新剪接變異體，命名為GRK4 variant X1和GRK4 variantX2。
　　結(jié)論：（1）從時(shí)間特異性角度，通過對(duì)不同年齡段卵巢組織的研究發(fā)現(xiàn) GRK4的表達(dá)水平隨著卵巢組織的發(fā)育程度而變化，提示其與組織生長發(fā)育調(diào)控有關(guān)；從空間特異性角度，G