G蛋白偶聯(lián)受體激酶4對大鼠血管平滑肌細胞AT1受體的異常調(diào)節(jié)在原發(fā)性高血壓中的研究.pdf

1、一．研究背景
　　原發(fā)性高血壓(essential hypertension EH)是多種心腦血管疾病的重要病因及危險因素，高血壓的發(fā)生除與中樞調(diào)節(jié)和腎臟鈉水潴留有關(guān)以外，血管的異常增殖也發(fā)揮了重要的作用，其中血管平滑肌細胞( vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、遷移和細胞外基質(zhì)的合成是高血壓發(fā)生、發(fā)展的重要細胞病理學基礎(chǔ)。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin II，Ang II)通過與血管

2、緊張素Ⅱ1型受體（Angiotensin II type1 receptor，AT1）結(jié)合刺激VSMCs增殖，在高血壓的血管重構(gòu)中占據(jù)了重要的地位；此外 Ang II亦可促進血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)的合成和釋放，促使兒茶酚胺異常釋放從而增加交感神經(jīng)活性；此外亦可通過促使腎臟水

3、、鈉潴留、刺激血管收縮致血管阻力增加等參與機體血壓水平的調(diào)控。
　　GRKs是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，共有7個類型(GRK1～7)，幾種亞型中，只有GRK4的活性改變先于高血壓的發(fā)生而發(fā)生。EH患者或高血壓大鼠血淋巴細胞 GRK2和GRK5表達和活性也升高，但這種變化僅是EH的一種繼發(fā)改變。人體中GRK4基因所在的染色體部位(4p16.3)與EH基因連鎖，至今發(fā)現(xiàn)的位于GRK4γ亞單位的3個SNP位點R65L、A142V、A4

4、86V可以顯著增加GRK4活性。GRK4 A142V轉(zhuǎn)基因小鼠正常鹽飲食情況下血壓顯著升高的同時腎臟AT1蛋白表達增加，給予GRK4 A142V轉(zhuǎn)基因小鼠腎動脈AngⅡ灌注后發(fā)現(xiàn)，其收縮壓明顯高于野生型對照小鼠；給予AT1受體拮抗劑干預，GRK4 A142V轉(zhuǎn)基因小鼠的血壓也明顯下降，提示GRK4可能是高血壓狀態(tài)下腎臟AT1受體功能增強的重要調(diào)節(jié)因子。但GRK4在血管組織是否亦發(fā)揮對AT1受體的調(diào)節(jié)作用目前尚未見文獻報道，我們在前期研究

5、發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞存在GRK4蛋白表達，因此，本課題擬利用大鼠胚胎鼠胸主動脈血管平滑肌細胞株(A10細胞株)為研究對象，抑制或過表達GRK4活性，分析其對血管平滑肌細胞AT1受體的表達和功能的影響，探討GRK4對AT1受體的調(diào)節(jié)機制或關(guān)鍵靶點，為預防高血壓并發(fā)癥的發(fā)生提供理論依據(jù)。
　　一．研究目的
　　明確GRK4受體對血管平滑肌細胞AT1受體的表達以及功能的影響，探討該調(diào)節(jié)作用與高血壓血管異常增殖之間的關(guān)系。
　　

6、二．研究內(nèi)容
　　1.驗證GRK4在血管平滑肌上表達，觀察GRK4對AT1受體表達及磷酸化的影響；
　　2. GRK4突變體A142V( hGRK4γA142V)轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞，進一步分析對AT1受體蛋白表達、磷酸化影響及潛在的調(diào)節(jié)機制。
　　3.GRK4野生型和突變體轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞，研究其對Ang II致血管平滑肌細胞促增殖影響，探討GRK4參與血管異常增殖調(diào)節(jié)的機理。
　　三、研究方法
　　1.

7、免疫組化驗證大鼠腸系膜動脈組織GRK4蛋白表達。
　　2.以大鼠胚胎鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(A10細胞)為研究對象，siRNA沉默GRK4蛋白表達后，Werstern blot方法觀察對 AT1受體蛋白表達；磷酸化絲氨酸免疫沉淀法分析AT1受體磷酸化改變；
　　3.慢病毒包裹人 GRK4野生型(hGRK4γWT)和突變體 A142V( hGRK4γA142V)轉(zhuǎn)染A10細胞，測定GRK4活性的變化、Werstern blo

8、t分析AT1受體表達及磷酸化絲氨酸免疫沉淀法分析AT1受體磷酸化改變；
　　4.免疫沉淀分析GRK4和AT1物理共連接；
　　5.[3H]胸腺嘧啶摻入法測定GRK4對AngⅡ促血管平滑肌細胞增殖變化。
　　四．研究結(jié)果
　　1.GRK4在大鼠腸系膜動脈肌層組織有豐富表達；
　　2．大鼠特異性GRK4 siRNA轉(zhuǎn)染A10細胞，GRK4蛋白表達和AT1受體表達降低、AT1受體磷酸化增加；
　　3．hGR