黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的克隆分析及黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系研究.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L是葫蘆科(Cucurbitaceae)—年生的草本植物。特別是黃瓜花性型分化多樣,其生理學(xué)和遺傳學(xué)研究豐富,黃瓜已成為研究植物性型分化的模式材料。
　　乙烯作為一種植物激素對(duì)植物的正常發(fā)育和脅迫反應(yīng)起著很重要的作用。在植株整個(gè)發(fā)育過程中,乙烯調(diào)控種子的萌發(fā)、種苗的生長(zhǎng)、果實(shí)的成熟、器官的衰老與脫落、花性別決定等生理過程。在黃瓜上,內(nèi)源乙烯與黃瓜雌花的形成正相關(guān),被稱為黃瓜的“性激素”,其性別

2、決定基因F和A/基因已經(jīng)被克隆,兩基因都編碼I-氨基環(huán)丙烷-I-羧酸合酶(ACS),其為乙烯生物合成途徑中的限速酶;而與乙烯生物合成途徑相比,黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)研究進(jìn)展十分緩慢,且途徑中的一些關(guān)鍵組分基因還未分離。
　　為加強(qiáng)對(duì)黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系的了解,本研究選取黃瓜雌雄異花同株品系S52為研究對(duì)象,克隆了3個(gè)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵成員基因,并在生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析、異源表達(dá)功能驗(yàn)證等方面開展了一系列工作,并取得以

3、下結(jié)果:
　　1.首次成功克隆出黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的CONSTITUTIVE TRIPLE及五見(9＃觀7-1丨]^基因(CTi^-Iike)的cDNA序列,命名為CsCTRl。該基因開放閱讀框2559bp,編碼852個(gè)氨基酸;位于6號(hào)染色體,含有15個(gè)外顯子、14個(gè)內(nèi)含子,在基因組中為單拷貝。與其他物種進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,CsCTRl與其他植物C T R l高度同源,在進(jìn)化過程中起源于同一祖先,且與南瓜、

4、甜瓜聚類在一簇。在擬南芥突變株中異源表達(dá)CvCTi"可以恢復(fù)正常的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),表明CsCTRl的確參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。CsCTRl在根、莖、成熟葉片、頂芽、成熟雌花和成熟雄花、幼果中都有表達(dá),且在成熟雄花中表達(dá)量最高,說明CsCTRl呈組成型表達(dá),且具有組織差異性;對(duì)不同發(fā)育時(shí)期雌花和雄花的表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果顯示在5個(gè)生長(zhǎng)階段,雄花的表達(dá)量一直高于雌花。雄花的表達(dá)量在Fl時(shí)期最高,之后呈降低趨勢(shì)。而雌花的表達(dá)量在Fl時(shí)期最低,之后呈

5、上升趨勢(shì),上升幅度不大。表明可能是在花發(fā)育早期發(fā)揮作用。另外,我們還發(fā)現(xiàn)基因在根、頂芽和葉中的表達(dá)都受外源乙烯的誘導(dǎo)。且在M近等基因系材料S52 iffM M)和B52(F F M M)中,B52頂芽和成熟雌花中CsCTRl的表達(dá)量明顯高于S52的表達(dá)量,我們推測(cè),CsCTRl在這一對(duì)近等基因系材料中表達(dá)量的差異可能是由于內(nèi)源乙烯不同而造成。
　　2.利用RT-PCR和R A C E技術(shù),首次成功克隆出黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途發(fā)中ETH

6、YLENE INSENSITIVE2基浪i E I N2)的全長(zhǎng)c D N A序列,命名為CsEIN2,其全長(zhǎng)4565bp,含有3873bp的ORF,編碼1290個(gè)氨基酸。CsEIN2位于6號(hào)染色體,含有7個(gè)外顯子、6個(gè)內(nèi)含子,在基因組中為單拷貝。與其他物種進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,CsEIN2與其他植物E IN2高度同源,在進(jìn)化過程中起源于同一祖先,且與甜瓜聚類在一簇。在擬南芥突變株中異源表達(dá)可以恢復(fù)正常的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),

7、說明CSEIN2的確參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在根、莖、成熟葉片、頂芽、成熟雌花和成熟雄花、幼果中都有表達(dá),說明C s E im呈組成型表達(dá)模式,但具有組織差異性。在黃瓜不同花發(fā)育時(shí)期,雄花中Cs:EIN2 mRNA的積累量基本沒有變化,雌花中Cv￡/＃2mRNA的積累量呈先上升后下降,但表達(dá)量變化不大。另外,我們還發(fā)現(xiàn)基因在根、頂芽和葉中的表達(dá)都不受外源乙烯誘導(dǎo),推測(cè)可能在蛋白水平受乙烯調(diào)控。在F//近等基因系材料S52 iffM M)和B5

8、2(F F M M)中,S52頂芽和成熟花中CsEIN2的表達(dá)量明顯高于B52的表達(dá)量。
　　3.利用RT-PCR和R A C E技術(shù),首次成功克隆出黃瓜乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中ETHYLENE INSENSITIVE3基因的全長(zhǎng) c D N A序列,命名為CsEIN3,其全長(zhǎng)2560bp,含有1908bp的ORF,編碼635個(gè)氨基酸。CsEIN3位于I號(hào)染色體,與基因組比較發(fā)現(xiàn)無內(nèi)含子,在基因組中為單拷貝。與其他物種進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)

9、及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,CsEIN3與其他植物E IN3/E IL高度同源,在進(jìn)化過程中起源于同一祖先,且與甜瓜聚類在一簇。在根、莖、成熟葉片、頂芽、成熟雌花和成熟雄花中都有表達(dá),表明呈組成型表達(dá)模式,但具有組織差異性。在黃瓜花發(fā)育不同時(shí)期,雄花和雌花中CvE/奶 mRNA的積累量都呈增加的趨勢(shì),而且雄花中的表達(dá)量一直高于雌花。另外,在近等基因系材料S52(JjMM)和B52(FFM M)中,S52頂芽和成熟花中CsEIN3的表達(dá)量明顯高

10、于B52的表達(dá)量。
　　4.采用黃瓜品系S52的子葉節(jié)為受體,通過根癌農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化PCAMBIA2301載體,對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,苗態(tài)為子葉剛脫離種殼時(shí)誘導(dǎo)率最高,達(dá)到100％,每塊外植體再生芽數(shù)可達(dá)4.13,且g u s表達(dá)率高于其他處理,其中經(jīng)輕傷口處理的外植體遺傳轉(zhuǎn)化率最高,而傷口太重則不利于轉(zhuǎn)化。在篩選出最佳苗態(tài)的基礎(chǔ)上研究了不同濃度6-BA和A B A對(duì)黃瓜子葉節(jié)離體再生的影響,獲得S

11、52品系最優(yōu)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L6-BA+0.5 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3。根據(jù)敏感性試驗(yàn)確定芽誘導(dǎo)和生根誘導(dǎo)選擇壓均為Kan50 mg/L。運(yùn)用gus瞬時(shí)表達(dá)法對(duì)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,得出預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為1-2 d,侵染時(shí)間20min,共培養(yǎng)3天時(shí)轉(zhuǎn)化效率較高。另外,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明在黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)合合適的篩選劑濃度對(duì)黃瓜子葉節(jié)轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用。
　　本研究