黃瓜果實彎曲相關基因Cs14-3-3的克隆及對擬南芥的遺傳轉化.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L.)是我國保護地栽培的重要蔬菜品種。果形是黃瓜重要的外觀品質之一，果實彎曲嚴重影響了黃瓜外觀品質，使黃瓜商品性顯著下降，從而給農民造成很大的經濟損失。因此，探究黃瓜果實彎曲的機理從而減少彎曲果實的比率在黃瓜育種及生產過程中至關重要。
　　 14-3-3蛋白是一類普遍存在于真核生物中高度保守的調節(jié)蛋白，它通過與靶蛋白的相互作用，參與生物體內的基本代謝、信號轉導、細胞分裂、光周期、生物脅迫、非

2、生物脅迫等多種調控過程，是生物體內重要的調節(jié)蛋白。實驗室前期的研究結果表明，14-3-3蛋白為彎曲黃瓜品種長春密刺果實腹部和果實脊部的差異表達蛋白，此蛋白在彎曲果實腹部的表達量顯著高于彎曲果實的脊部，且編碼此蛋白的核苷酸序列與黃瓜果實彎曲緊密連鎖的分子標記位于同一染色體上，這暗示著14-3-3蛋白基因可能在黃瓜果實彎曲過程中發(fā)揮著重要作用。
　　 本研究以黃瓜果實彎曲品種長春密刺為試驗材料，通過RT-PCR方法分離并克隆了黃瓜果

3、皮14-3-3蛋白基因，并采用實時熒光定量PCR方法對順直果實和彎曲果實腹部及脊部在果實開花的2、4、6、8、10、12天的基因表達量進行了研究。構建了植物過表達載體和RNA干擾載體，通過花序侵染法對擬南芥進行了遺傳轉化，希望能為揭示黃瓜果實彎曲的分子機理奠定基礎。主要研究結果如下:
　　 (1)克隆了黃瓜果皮14-3-3蛋白基因，并將此基因命名為Cs14-3-3。Cs14-3-3基因cDNA全長792bp，編碼263個氨基酸，

4、氨基酸序列含有14-3-3蛋白保守結構域，屬于14-3-3超級家族。基因序列同源性比對發(fā)現，黃瓜與葡萄的基因序列同源性最高為86％，與橡膠樹、木薯、大黃、煙草、擬南芥同源性分別達到80％以上。氨基酸序列同源性比對發(fā)現，黃瓜與橡膠樹、木薯、龍眼、擬南芥的相似性最高，均達到90％以上。分子進化樹顯示，黃瓜與葡萄、橡膠樹、木薯和歐洲山毛櫸處于同一個進化支上，親緣關系最近。Cs14-3-3基因編碼蛋白是一個不穩(wěn)定親水蛋白，不具有跨膜結構，含有一

5、個14-3-3蛋白信號序列Ⅰ位點，一個14-3-3蛋白信號序列Ⅱ位點，多個磷酸化位點、酰基化位點和糖基化位點。主要定位在細胞核和細胞質中。
　　 (2)對Cs14-3-3基因在黃瓜順直果實和彎曲果實腹部及脊部在果實發(fā)育不同時期的表達情況進行的分析結果表明，無論是順直果實還是彎曲果實的腹部或脊部，Cs14-3-3在果實開花2天的表達量明顯高于開花后其他時期，從果實開花4天到12天，隨著果實的生長發(fā)育，Cs14-3-3基因的表達量在

6、一定范圍內浮動，無明顯的增加或減少趨勢。在果實發(fā)育的不同時期，Cs14-3-3基因在順直果實和彎曲果實腹部及脊部的表達量均呈現彎曲果實腹部＞順直果實＞彎曲果實脊部的趨勢。說明Cs14-3-3基因與黃瓜果實彎曲有關，為黃瓜果實彎曲相關基因，且此基因在黃瓜果實開花早期發(fā)育過程中起重要作用。
　　 (3)構建了Cs14-3-3基因過表達載體，命名為PBI121-M14-3-3;構建了Cs14-3-3基因RNA干擾載體，命名為PBI12