枇杷種質(zhì)限制生長保存及乙烯代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因等克隆及表達(dá).pdf

1、本試驗首先以“早鐘6號”枇杷為材料，進(jìn)行胚培養(yǎng)及其試管苗保存條件的優(yōu)化研究，并離體保存了21份枇杷資源的試管苗；同時，以“早鐘6號”試管苗葉片為材料，克隆得到乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因ETR、ERS以及抗氧化相關(guān)基因CAT的cDNA全長序列，并以枇杷試管苗離體保存不同時期葉片為材料，進(jìn)行ETR、ERS、CAT等3個基因及本實驗室音建華（2010）已克隆的2個基因ACS和ACO在離體保存過程中表達(dá)量的qPCR分析。主要研究結(jié)果如下：
　　

2、1、枇杷胚培養(yǎng)及試管苗的獲得
　　以早鐘6號枇杷幼胚為材料，研究不同濃度GA3及光質(zhì)對幼胚萌發(fā)率的影響。不同濃度GA3對幼胚的萌發(fā)影響較大，其中1/2 MS+0.2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1 GA3的萌發(fā)率最高；不同光質(zhì)對枇杷幼胚對幼胚萌發(fā)率影響不大，紅光、藍(lán)光均促進(jìn)幼胚萌發(fā)。在枇杷成熟胚培養(yǎng)中，6-BA對枇杷成熟胚萌發(fā)率影響最大，NAA影響最小，適合的萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg

3、·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA。
　　2、枇杷試管苗的增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)
　　將枇杷幼胚萌發(fā)得到的試管苗，接入添加不同濃度的TDZ或KT的增殖培養(yǎng)基中，研究TDZ或KT對枇杷試管苗增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)適合枇杷試管苗增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 TDZ或MS+0.1 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT。最適合的生根培養(yǎng)基為

4、0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA+1/2 MS，生根率為93.095%。
　　3、21份枇杷種質(zhì)資源試管苗的離體保存研究
　　本試驗將枇杷試管苗接入1/3 MS+4.0 mg·L-1PP333培養(yǎng)基上，分別置于4種不同光質(zhì)下培養(yǎng)，探討不同光質(zhì)對試管苗離體保存的影響。紅光有利于枇杷試管苗的離體保存，枇杷試管苗在紅光條件下，離體保存效果較好，保存11個月時，試管苗存活率仍有70%以上。另外，收集21份枇杷資

5、源，將枇杷胚接種在1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，并直接對21份枇杷資源進(jìn)行離體保存，21份枇杷種質(zhì)資源離體保存存在差異。
　　4、枇杷試管苗葉片乙烯受體基因ETR基因的克隆
　　以枇杷試管苗葉片為材料，采用同源克隆方法得到3條ETR1 cDNA全長序列，分別命名為Ej-ETR1a、Ej-ETR1b、Ej-ETR1c，編碼相同的741個氨基酸；4條ETR2 cDNA全長序列，分別命名為 Ej-ETR2a、Ej-ETR2b、Ej-E

6、TR2c、Ej-ETR2d，編碼相同的741個氨基酸。各基因cDNA序列GenBank檢索號分別為JX307084、JX307087、JX996185、JX307089、JX307090、JX307091、KC709505。根據(jù)生物信息學(xué)分析，推測兩類ETR蛋白均是不穩(wěn)定的疏水性蛋白，不含信號肽；在N-端疏水區(qū)存在3個跨膜區(qū)，屬于跨膜蛋白；有一個螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜中，具有8個保守結(jié)構(gòu)域，均屬于ethylene sensor

7、家族；ETR1蛋白具有30個功能位點，32個磷酸化位點，ETR2蛋白有28個功能位點，35個磷酸化位點，兩個基因的氨基酸序列相似性為95.28%，均屬于乙烯受體ETR1亞家族
　　5、枇杷試管苗葉片乙烯受體基因ERS基因的克隆
　　從枇杷試管苗葉片中克隆得到1條ERS cDNA序列，全長2170 bp，編碼673個氨基酸， GenBank檢索號為JX307088。對該蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，推測該蛋白為不穩(wěn)定的疏水性蛋白，不

8、含信號肽，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜；除了近N-端的3個跨膜區(qū)域外，Ej-ERS蛋白還有294-315 aa及320-341aa兩處跨膜區(qū)；該蛋白有1個螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，28個功能位點，26個磷酸化位點，與枇杷ETR1、ETR2同屬于乙烯受體ETR1亞家族。
　　6、枇杷試管苗葉片CAT基因的克隆
　　采用同源克隆方法，從枇杷試管苗葉片中得到6條CAT cDNA序列全長，其中1條CAT1序列、5條CAT2序列，分別命名為Ej-CAT1、

9、Ej-CAT2、Ej-CAT2-2、Ej-CAT2-3、Ej-CAT2-4、Ej-CAT2-5。GenBank檢索號分別為：JX307086、JX307085、JX996184、JX996186、JX996187、JX996188。對CAT1及CAT2推到的氨基酸進(jìn)行生物信息學(xué)分析，兩個蛋白均編碼492個氨基酸，是親水蛋白，不含信號肽，不存在螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，是非跨膜蛋白，亞細(xì)胞定位于過氧化物酶體；CAT1及CAT2蛋白分別有18、17個功

10、能位點，22、19個磷酸化位點，是以Ser為主，Thr、Tyr為輔發(fā)生磷酸化反應(yīng)。
　　7、枇杷試管苗離體保存過程中乙烯代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因等表達(dá)的qPCR分析
　　本試驗以在1/3MS+4.0 mg·L-1 PP333培養(yǎng)基上離體保存的不同時期枇杷試管苗葉片為材料，以Actin為內(nèi)參基因，采用qPCR方法分析枇杷乙烯代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因ETR、ERS、ACS、ACO以及抗氧化相關(guān)基因 CAT在離體保存過程中的表達(dá)規(guī)律。

11、結(jié)果表明：5個基因在6個不同保存時期均有表達(dá)。其中，ETR基因整體表達(dá)量先降低后上升，最后趨向平穩(wěn)，保存1個月時表達(dá)量最高，保存5個月表達(dá)量最低；ERS基因表達(dá)量呈“W”狀，保存7個月表達(dá)量最高，保存5個月時表達(dá)量相對最低；ACS基因表達(dá)量變化較復(fù)雜，整體趨勢先上升后下降，之后又有所上升，最后又開始下降直至降到最低值（保存11個月）；ACO基因的表達(dá)量在保存1個月及4個月時較高，其后的4個時期表達(dá)量沒有明顯變化；而CAT基因表達(dá)量的整體

12、趨勢呈字母“W”形狀，保存1個月時表達(dá)量最高，7個月時表達(dá)量最低。
　　在枇杷試管苗離體保存的整個過程中，乙烯受體基因ETR、ERS與ACS表達(dá)模式基本相似，但在保存4個月、11個月時ACS表達(dá)量與受體基因表達(dá)量變化趨勢相反，4個月ACS表達(dá)量增加，而受體基因的表達(dá)量則降低；11個月時，ACS表達(dá)量下降，ETR、ERS表達(dá)量則略升。枇杷ACO基因除了在4、7個月表達(dá)量動態(tài)變化不一致外，其余幾個時期的變化規(guī)律幾乎與ETR、ERS表達(dá)

13、量變化趨勢類似。
　　ACS與ACO表達(dá)量動態(tài)變化趨勢基本一致，且ACS每個時期表達(dá)量均高于ACO的表達(dá)量。前2個時期表達(dá)量增加，可能是由于試管苗生長發(fā)育進(jìn)入葉片成熟和衰老階段，乙烯合成量增加；而在離體保存后4個時期，試管苗新的側(cè)芽開始生長，抽出新的枝葉，并慢慢發(fā)育成熟，但ACO表達(dá)量卻無明顯變化，乙烯生成量趨于穩(wěn)定，這可能跟乙烯受體表達(dá)量變化有關(guān)。ACS處于ACO的上游，每個時期的ACS基因的表達(dá)量均高于ACO基因的表達(dá)量，說明