黃瓜徒長苗特征及相關(guān)基因CKO的克隆與表達分析.pdf

1、黃瓜(CucumissativusL.)是普遍栽培的世界性蔬菜，也是重要的設(shè)施蔬菜，在市場供應(yīng)中占有重要的地位。黃瓜主要采用育苗栽培，但在育苗過程中，如果遇到高溫高濕、光照不足、水分過多等環(huán)境不適情況時，秧苗易徒長，導(dǎo)致幼苗質(zhì)量下降，進而對定植后植株的營養(yǎng)生長和生殖生長產(chǎn)生影響，最終影響產(chǎn)量和品質(zhì)。植株幼苗的過度生長是以赤霉素（gibbereilin，GA）為中心的激素不平衡造成的。植物中GA生物合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強時，會呈現(xiàn)相應(yīng)長的下胚

2、軸表型，形成徒長苗。貝殼杉烯氧化酶基因（KO）是目前研究相對較多的GA生物合成限速酶基因，但黃瓜KO的克隆還未見報道。本試驗以黃瓜品種‘戴多星’為試材，克隆到赤霉素合成的關(guān)鍵酶-貝殼杉烯氧化酶(KO)基因cDNA全長序列，比較了正常光溫條件、正常溫度結(jié)合黑色遮陽網(wǎng)遮光及正常溫度結(jié)合黑色遮陽網(wǎng)遮光同時噴施多效唑3個處理下，生長指標、下胚軸細胞的超微結(jié)構(gòu)和CKO的表達水平的差異，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)得到轉(zhuǎn)基因初代煙草植株，為黃瓜徒長機理的研究提

3、供理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　 1.以黃瓜品種‘戴多星’為試材，研究正常光溫條件、正常溫度結(jié)合黑色遮陽網(wǎng)遮光及正常溫度結(jié)合黑色遮陽網(wǎng)遮光同時噴施多效唑?qū)S瓜幼苗生長狀態(tài)及下胚軸細胞超微的影響。結(jié)果表明:相比于正常條件下的幼苗，遮光使黃瓜幼苗下胚軸長度顯著增加，下胚軸粗顯著降低，干重顯著減少，壯苗指數(shù)下降，表現(xiàn)出明顯的徒長狀態(tài)。噴施多效唑能有效的控制幼苗徒長，提高壯苗指數(shù)。超微結(jié)構(gòu)觀測表明:與正常苗相比，徒長苗下胚軸細胞葉綠體長

4、度變長，基粒數(shù)及基質(zhì)片層垛疊增多，淀粉粒消失，嗜鋨體小球減少;線粒體增多，且發(fā)育較為成熟，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕微的腫脹。噴施多效唑?qū)е孪屡咻S細胞葉綠體基質(zhì)片層松散、腫脹，嗜鋨體小球增多、增大;線粒體輕微的腫脹。
　　 2.應(yīng)用同源克隆和RACE技術(shù)從黃瓜莖尖中克隆得到赤霉素合成的關(guān)鍵酶—貝殼杉烯氧化酶（KO）基因cDNA全長序列，命名為CKO，GeneBank登錄號為JN792591，其長度為1895bp，開放閱讀框(ORF)編碼519個

5、氨基酸的蛋白，相對分子量為59.211kD，等電點(PI)為8.45。氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，CKO與苦瓜的KO氨基酸序列同源性最高，達84％;序列結(jié)構(gòu)分析表明，CKO屬于細胞色素超家族P450系，具有細胞色素P450的血紅素結(jié)構(gòu)域FXXGXRXCXG和跨膜結(jié)構(gòu)域。實時熒光定量分析表明，CKO在遮光的徒長苗中表達量最高，是正常苗中的5.18倍，在遮陰條件下噴施多效唑可降低該基因的表達。
　　 3.以黃瓜品種‘戴多星’為試材，利用帶

6、酶切位點的引物克隆得到該品種基因組中貝殼杉烯氧化酶(CKO)基因的編碼區(qū)，將該基因插入到植物表達載體pCAMBIA1301-1中，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。通過葉盤法將CKO介導(dǎo)入煙草葉片中，利用潮霉素對轉(zhuǎn)化植株進行初步篩選，經(jīng)愈傷、分化后，對潮霉素陽性植株進行進一步的PCR檢測和GUS組織化學分析。GUS組織化學分析顯示，在轉(zhuǎn)基因煙草的愈傷組織和葉中都表現(xiàn)出GUS活性;PCR檢測表明，CKO已經(jīng)整合到煙草基因組中。研究結(jié)果為進一步