草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、酶學(xué)性質(zhì)研究及AlbD酶S40位點飽和突變分析.pdf

1、草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（GAT）能通過N-乙酰化的作用使草甘膦脫毒，在抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物中具有潛在的應(yīng)用價值。本實驗通過PCR程序首次從提取的土壤總DNA中擴(kuò)增出草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（gat基因）。酶解后插入表達(dá)載體pGEX-6p-1，獲得重組質(zhì)粒pGEX-gat。將它轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，獲得可以表達(dá)GST-GAT融合蛋白的重組菌株?；驕y序表明，與來自地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的AX543338核

2、苷酸序列有99.3％的同源性，與AX543339和AX543340分別有93％和95.2％的同源性。將GAT酶用親和層析純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示gat基因表達(dá)了17kDa的蛋白質(zhì)，與來自GAT酶基因序列所推導(dǎo)的分子量一致。對該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，該酶的最適溫度為30℃，最適反應(yīng)pH為7。同時檢測了6種金屬離子對酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)雖然GAT的活性不依賴于金屬離子的存在，但單價離子K<'+>、Na<'+>和雙價

3、離子Mg<'2+>和Mn<'2+>對GAT酶均有激活作用。相比之下，單價離子的激活作用高于雙價離子，其中Na<'+>的激活作用最強(qiáng)，使酶相對活性提高了48.3％；而Ca<'2+>有明顯的抑制作用，使活性下降63.7％。 葉灼病是甘蔗主要病害之一，由一種植物性毒素albicidin所引起。我室從歐文氏菌（Erwinia herbicola）中分離到一種可降解albicidin的AlbD酶。通過序列比較發(fā)現(xiàn)AlbD酶和酯酶擁有相同：

4、motif-LXXXGXXG──GXSXG。因此，選用不同鏈長的酯化合物作為底物進(jìn)行酯酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)對脂肪酸鏈長C<,2>-C<,8>的酯均有活性。前期研究工作發(fā)現(xiàn)AlbD酶$40位點可能是該酶活性中心的一部分，改變該位點可能會改變該酶活性。為了弄清該位點誘變對酶活性的影響，我們利用新的PCR誘變技術(shù)對AlbD酶S40位點進(jìn)行飽和突變，將該位點的Ser變?yōu)槠渌?9種氨基酸，獲得了19種不同的突變子，測試了不同突變子的脫毒活性和酯酶活性