飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因克隆及特性研究.pdf

1、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)廣泛存在，在化學殺蟲劑的解毒代謝過程中發(fā)揮主要的作用。飛蝗是主要的農(nóng)業(yè)害蟲之一，對我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)為害較大。近年來，隨著氣候的變化及生態(tài)環(huán)境的破壞，蝗蟲為害日益嚴重，并且隨著化學殺蟲劑的濫用導(dǎo)致蝗蟲對殺蟲劑的敏感性降低。為了能更有效地治理蝗蟲，本文以飛蝗為材料，對谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶在分子和蛋白水平進行系統(tǒng)的研究。主要內(nèi)容如下:
　　一、飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因克隆
　　從飛蝗EST數(shù)據(jù)庫中獲得10個飛蝗

2、GSTs序列片段，在NCBI數(shù)據(jù)庫中經(jīng)BLASTX比對確認，通過RACE-PCR技術(shù)獲得10個飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶cDNA全長序列。經(jīng)過氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化聚類分析9個GSTs屬于三個家族細胞質(zhì)GSTs，其中1個屬于delta家族(LmGSTd1)，7個屬于sigma家族(LmGSTs1，LmGSTs2，LmGSTs3，LmGSTs4，LmGSTs5，LmGSTs6和LmGSTs7)，1個屬于theta家族（LmGSTt1）。剩余的

3、1個GST與已知家族昆蟲GSTs有較低的相關(guān)性，歸為unclassified家族(LmGSTu1)。
　　二、飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因分子特性研究
　　采用RT-PCR方法，檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因在飛蝗卵、1齡到成蟲不同發(fā)育階段的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LmGSTs2，LmGSTs4，LmGSTs6和LmGSTs7四個基因在卵階段mRNA的表達量較低，LmGSTu1在卵期未見表達。LmGSTd1，LmGSTs1，LmGSTs3，

4、LmGSTs5和LmGSTt1在飛蝗各個發(fā)育階段表達情況沒有明顯變化。采用RT-PCR方法，檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因在飛蝗前腸、中腸、胃盲囊、后腸、馬氏管、脂肪體、肌肉、精巢和卵巢9個不同組織部位的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LmGSTd1，LmGSTs1，LmGSTs3，LmGSTs5，LmGSTs6和LmGSTt16個基因在所有組織中都表達。LmGSTs2，LmGSTs4，LmGSTs7和LmGSTu1在部分組織部位表達。Real-time

5、PCR研究發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯濃度在0.08μg/mL與0.12μg/mL時，飛蝗3齡蝗蝻的10個谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因mRNA表達量增加。然而當溴氰菊酯濃度在0.16μg/mL或0.2μg/mL時LmGSTd1，LmGSTs1，LmGSTs5和LmGSTs6的mRNA表達量降低。溴氰菊酯處理后飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因mRNA表達量增加，可能會導(dǎo)致飛蝗對其它殺蟲劑和異源物質(zhì)的耐受力提高。
　　三、飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶原核表達和蛋白特性研究<

6、br>　　在大腸桿菌中成功表達并經(jīng)過純化獲得可溶性蛋白LmGSTt1和LmGSTs1。LmGSTt1和LmGSTs1都能與CDNB(1-chloro-2，4-dinitrobenzene)和p-NBC(p-nitro-benzyl chloride)兩種底物發(fā)生反應(yīng)，其中CDNB是其最適底物。在40℃以下LmGSTt1和LmGSTs1都具有較好的穩(wěn)定性。在GST的抑制劑ECA(ethacrynic acid)和RB(reactive b

7、lue)的濃度為0.05mM時，LmGSTt1的活性分別降至37±1％和6±0.1％。ECA對LmGSTt1的I50值是12.6μM。RB對LmGSTt1的I50值是4.41μM;LmGSTs1的活性分別降至81±3％和41±3％。RB對LmGSTs1的I50值是18.5μM。毒死蜱、溴氰菊酯、馬拉硫磷和西維因殺蟲劑的濃度為0.05mM時，LmGSTt1的活性分別降至71±3％，88±2％，94±2％和83±1％，而LmGSTs1對上述