16081.環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶和羰基還原酶基因表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

1、分類號(hào)：Q815密級(jí)：(秘密、機(jī)密、絕密)學(xué)校代碼：10057研究生學(xué)號(hào)：10809935環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶和羰基還原酶基因表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究ExpressionandCharacterizationofCyclodextrinGlycosyltransferaseandCarbonylReductase工程領(lǐng)域名稱：輕工技術(shù)與工程研究方向：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師姓名：楊洪江教授朱敦明研究員研究生姓名：田來強(qiáng)申請(qǐng)學(xué)位類別：工程碩士論文提交日期：

2、2013年1月論文課題來源：自選項(xiàng)目學(xué)位授予單位：天津科技大學(xué)摘要由于傳統(tǒng)化學(xué)工業(yè)對(duì)環(huán)境的污染越來越引起人們的重視，生物催化(酶催化和全細(xì)胞催化)越來越多的應(yīng)用于化合物的工業(yè)生產(chǎn)。環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CyclodextrinGlycosyltransferase／Glucanotransferase)簡稱為CGTase，(EC24119)屬于Ⅱ淀粉酶家族，能夠催化直鏈淀粉生成環(huán)糊精(Cyclodextrin，CD)。13CD有非常優(yōu)越

3、的理化性質(zhì)和包結(jié)行為，可以更好將許多物質(zhì)包裹起來從而改變物質(zhì)的溶解度、揮發(fā)性等理化性質(zhì)，因此13CD的開發(fā)引人注目。近年來CGTase已經(jīng)引起人們?cè)絹碓礁叩闹匾?，成為了人們研究的熱點(diǎn)。建立了一個(gè)快速篩選產(chǎn)CGTase菌株的方法，通過酚酞作指示劑，以淀粉為唯一碳源富集培養(yǎng)，通過透明圈大小進(jìn)行菌株的篩選。從特定的100個(gè)土壤樣品中篩得18株產(chǎn)CGTaSe的菌株，對(duì)其中的一株進(jìn)行了詳細(xì)研究。對(duì)野生菌的生長狀況作了研究，在25h左右達(dá)到穩(wěn)定期，

4、通過對(duì)菌的形態(tài)觀察：在固體培養(yǎng)基上生長時(shí)菌落成不規(guī)則圓形，培養(yǎng)5天，菌落直徑在2cm左右。淡黃色，表面光滑，黃色。通過顯微鏡觀察，菌體形態(tài)為短桿狀，革蘭氏染色后呈紅色，因此為革蘭氏陰性菌、16SrDNA序列擴(kuò)增：通過對(duì)菌株V21的16SrDNA進(jìn)行比對(duì)，其與芽孢桿菌Bacillussp同源性很高，達(dá)到99％，以及進(jìn)化樹繪制對(duì)菌進(jìn)行鑒定，確定野生菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜集相關(guān)序列信息，設(shè)計(jì)簡并引物，后

5、根據(jù)擴(kuò)增序列結(jié)果再設(shè)計(jì)引物，最終從篩選菌株中成功克隆得到目的基因，基因共2172bp，編碼724個(gè)氨基酸。N端包含一個(gè)信號(hào)肽，根據(jù)預(yù)測結(jié)果及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，信號(hào)肽約為48個(gè)氨基酸。目的蛋白在大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)中成功表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為250C，時(shí)間為80h，蛋白為胞外蛋白，不含信號(hào)肽。發(fā)酵液濃縮后SDSPAGE驗(yàn)證并進(jìn)行酶活測定，發(fā)酵液中酶活達(dá)到1U／mL。通過QSepharose離子交換柱和phenylSe

6、pharose疏水柱，對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化，最終得到較純的目的蛋白。手性醇是合成一些有高附加值化學(xué)品的基石，最直接得到手性醇的方法是化學(xué)法和生物催化法還原前手性的酮類。生物法作為一種化學(xué)方法的補(bǔ)充已經(jīng)用于一些手性醇的生產(chǎn)，羰基還原酶就可以催化酮的不對(duì)稱還原生成對(duì)應(yīng)的手性醇。畢赤酵母GSl15基因組已經(jīng)得以測序，本文通過對(duì)畢赤酵母GSl15基因組序列分析同時(shí)與已知的羰基還原酶的蛋白序列比對(duì)，在2號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能的羰基還原酶基因pp