16081.環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶和羰基還原酶基因表達及酶學性質(zhì)研究

1、分類號：Q815密級：(秘密、機密、絕密)學校代碼：10057研究生學號：10809935環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶和羰基還原酶基因表達及酶學性質(zhì)研究ExpressionandCharacterizationofCyclodextrinGlycosyltransferaseandCarbonylReductase工程領域名稱：輕工技術與工程研究方向：發(fā)酵工程指導教師姓名：楊洪江教授朱敦明研究員研究生姓名：田來強申請學位類別：工程碩士論文提交日期：

2、2013年1月論文課題來源：自選項目學位授予單位：天津科技大學摘要由于傳統(tǒng)化學工業(yè)對環(huán)境的污染越來越引起人們的重視，生物催化(酶催化和全細胞催化)越來越多的應用于化合物的工業(yè)生產(chǎn)。環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CyclodextrinGlycosyltransferase／Glucanotransferase)簡稱為CGTase，(EC24119)屬于Ⅱ淀粉酶家族，能夠催化直鏈淀粉生成環(huán)糊精(Cyclodextrin，CD)。13CD有非常優(yōu)越

3、的理化性質(zhì)和包結(jié)行為，可以更好將許多物質(zhì)包裹起來從而改變物質(zhì)的溶解度、揮發(fā)性等理化性質(zhì)，因此13CD的開發(fā)引人注目。近年來CGTase已經(jīng)引起人們越來越高的重視，成為了人們研究的熱點。建立了一個快速篩選產(chǎn)CGTase菌株的方法，通過酚酞作指示劑，以淀粉為唯一碳源富集培養(yǎng)，通過透明圈大小進行菌株的篩選。從特定的100個土壤樣品中篩得18株產(chǎn)CGTaSe的菌株，對其中的一株進行了詳細研究。對野生菌的生長狀況作了研究，在25h左右達到穩(wěn)定期，

4、通過對菌的形態(tài)觀察：在固體培養(yǎng)基上生長時菌落成不規(guī)則圓形，培養(yǎng)5天，菌落直徑在2cm左右。淡黃色，表面光滑，黃色。通過顯微鏡觀察，菌體形態(tài)為短桿狀，革蘭氏染色后呈紅色，因此為革蘭氏陰性菌、16SrDNA序列擴增：通過對菌株V21的16SrDNA進行比對，其與芽孢桿菌Bacillussp同源性很高，達到99％，以及進化樹繪制對菌進行鑒定，確定野生菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜集相關序列信息，設計簡并引物，后

5、根據(jù)擴增序列結(jié)果再設計引物，最終從篩選菌株中成功克隆得到目的基因，基因共2172bp，編碼724個氨基酸。N端包含一個信號肽，根據(jù)預測結(jié)果及實驗驗證，信號肽約為48個氨基酸。目的蛋白在大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)中成功表達，誘導溫度為250C，時間為80h，蛋白為胞外蛋白，不含信號肽。發(fā)酵液濃縮后SDSPAGE驗證并進行酶活測定，發(fā)酵液中酶活達到1U／mL。通過QSepharose離子交換柱和phenylSe

6、pharose疏水柱，對目的蛋白進行了純化，最終得到較純的目的蛋白。手性醇是合成一些有高附加值化學品的基石，最直接得到手性醇的方法是化學法和生物催化法還原前手性的酮類。生物法作為一種化學方法的補充已經(jīng)用于一些手性醇的生產(chǎn)，羰基還原酶就可以催化酮的不對稱還原生成對應的手性醇。畢赤酵母GSl15基因組已經(jīng)得以測序，本文通過對畢赤酵母GSl15基因組序列分析同時與已知的羰基還原酶的蛋白序列比對，在2號染色體上發(fā)現(xiàn)了一個可能的羰基還原酶基因pp