基于磁珠分離和滾環(huán)擴增電化學發(fā)光方法在基因點突變檢測中的應用.pdf

1、腫瘤基因突變分析在各種遺傳相關(guān)疾病早期臨床診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用，而且還被應用于抗藥性早期監(jiān)測。因為遺傳相關(guān)疾病會存在大量的特異位點的基因突變，同一個體不同組織的基因突變位點也會有差異，因此發(fā)展一種高靈敏的，快速的，準確同時簡單的基因突變檢測的方法已成為科學研究的熱點話題。
　　 基因點突變分析技術(shù)大概包括兩大部分：等位基因識別技術(shù)和等位基因檢測技術(shù)。引物延伸技術(shù)、等位特異性雜交技術(shù)、限制性內(nèi)切酶技術(shù)以及寡核苷酸連接技術(shù)等

2、為目前常見的基因識別技術(shù)。其中酶依賴的識別技術(shù)憑借其操作簡單，成本低，而且特異性高的優(yōu)點而受到科學界的廣泛關(guān)注。利用連接酶和恒溫擴增酶介導的基因識別技術(shù)則由于其適合識別任何位點的基因型而具備實現(xiàn)高通量檢測的潛力，成為目前識別技術(shù)發(fā)展的焦點。滾環(huán)擴增作為一種可以大量擴增核酸序列的方法被廣泛應用，其既可進行靶核酸擴增，又可實現(xiàn)信號放大擴增。在等位基因檢測技術(shù)方面，比較傳統(tǒng)的方法有變性凝膠電泳，質(zhì)譜以及熒光檢測技術(shù)，這些方法具有高靈敏的優(yōu)點，

3、但由于實驗操作繁雜，成本高限制了他們的普遍應用。
　　 電化學發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）分析方法是近些年發(fā)展起來的一種極高靈敏度的檢測方法，它有效地將電化學方法與化學發(fā)光結(jié)合于一體，利用三聯(lián)吡啶釕與三丙胺在電極表面發(fā)生氧化還原反應而產(chǎn)生高效，穩(wěn)定地發(fā)光，具有簡單、快速、靈敏度高、適用性廣等特點，已經(jīng)廣泛應用于免疫檢測和藥物分析中。
　　 實驗中將高特異性滾環(huán)擴增方法與高靈敏的電化學發(fā)

4、光檢測技術(shù)結(jié)合起來，發(fā)展了一種特異而靈敏的基因點突變分析技術(shù)。本實驗通過設計特異性的閉合探針、捕捉探針、信號探針，使基于酶連接反應生成環(huán)狀的單鏈核酸序列，以此環(huán)狀單鏈核酸序列為模板進行滾環(huán)擴增最終生成長的核酸序列，從而使大量的信號探針與之結(jié)合而提高了靈敏度。與信號探針雜交結(jié)合的滾環(huán)擴增產(chǎn)物通過鏈酶親和素和生物素的特異性結(jié)合被分離純后富集在電極表面直接進行電化學發(fā)光檢測，分離純化操作簡單快速，而且具有富集的作用，提高了電化學發(fā)光的檢測效率

5、。該方法的檢測靈敏度可以達到100 fM的水平，同時具有非常好的檢測特異性。實驗結(jié)果表明該方法可以作為一種靈敏度高，可靠性強的核酸突變檢測方法，并且有望發(fā)展成為臨床突變分析的方法。同時此方法在汞離子檢測中得到了擴展應用，在檢測中汞離子檢測靈敏度達到了100 pM的水平，同時還保持了非常好的離子選擇性。通過結(jié)合重金屬汞離子檢測驗證了此方法具有非常好應用延展性。這些結(jié)果說明滾環(huán)擴增和電化學發(fā)光方法的結(jié)合為各種小分子檢測提供一個高效率的途徑，