醛固酮對減壓神經(jīng)中ENaC表達的影響.pdf

1、背景介紹：
　　心力衰竭（Heart failure, HF）簡稱心衰，是各種心臟疾病，比如冠心病、高血壓以及慢性腎臟病等各種心血管疾病發(fā)展的終末階段。
　　壓力反射（baroreflex）又稱減壓反射，是心血管活動調(diào)節(jié)的重要機制之一。位于主動脈弓和頸動脈竇的感覺神經(jīng)末梢感受動脈血壓的變化，經(jīng)減壓神經(jīng)和竇神經(jīng)傳入，到達心血管中樞，通過調(diào)節(jié)交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的功能，平衡心血管活動。1969年Smyth等人首次以Smyth法測定

2、BRS（baaroreflex sensitivity）來表示壓力反射的敏感性。心衰動物的壓力反射敏感性明顯降低，擾亂自主神經(jīng)平衡，導致交感神經(jīng)興奮性增強，副交感神經(jīng)活動降低，從而使發(fā)病率和死亡率增加。據(jù)文獻報道，減壓反射的傳入神經(jīng)敏感性和興奮性降會低導致減壓反射敏感性降低，但至今尚不清楚傳入神經(jīng)對血壓變化敏感性降低的機制。研究發(fā)現(xiàn)HF引起Na+通道功能降低抑制了減壓神經(jīng)的電活動，而在減壓神經(jīng)末梢上存在著感受血壓變化的機械敏感性離子通道

3、，心衰可能是改變了這種機械敏感性離子通道的功能，降低減壓神經(jīng)對血壓變化的敏感性。
　　上皮鈉通道(Epithelial Sodium Channel，ENaC)屬于ENaC/Deg家族，具有阿米洛利敏感性，是該家族中目前研究最為廣泛的分子。ENaC是由α、β、γ、δ四種亞基組成的異源多聚體蛋白，主要分布于腎臟等上皮組織中，功能是維持水，鈉平衡。通過醛固酮與細胞內(nèi)的醛固酮受體結(jié)合，增加ENaC通道在細胞膜上的表達，調(diào)節(jié)ENaC介導的

4、Na+細胞轉(zhuǎn)運。在神經(jīng)節(jié)等非上皮組織中，ENaC是機械敏感性離子通道。
　　發(fā)生心力衰竭（HF）時醛固酮顯著升高，升高正常動物或者人血液中的醛固酮顯著降低減壓反射的敏感性。已有實驗發(fā)現(xiàn)減壓神經(jīng)末梢和胞體中有ENaC通道蛋白的分布，而對醛固酮是否影響減壓神經(jīng)中ENaC通道及其可能機制尚未報道。
　　目的：
　　本實驗模擬心衰引起大鼠機體醛固酮濃度升高，觀察減壓反射敏感性變化，以及結(jié)狀神經(jīng)節(jié)的減壓神經(jīng)胞體中ENaC表達變化

5、，以確定血漿醛固酮升高是否影響減壓神經(jīng)中ENaC通道的表達。
　　方法：
　　1、采用滲透泵持續(xù)灌輸醛固酮的方法，制作高醛固酮動物模型。體重200 g的SD雄性大鼠在10％的水合氯醛腹腔麻醉狀態(tài)下，于腹背后皮下植入 Alzet2004微型滲透泵。
　　2、30只健康雄性SD大鼠給予正常飼料，適應喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組，均喂養(yǎng)4周。所有的大鼠在20％的烏拉坦（0.5 ml/100 g）腹腔麻醉下，①正常對照組（CON，

6、n=6）：正常飲食和飲水。②溶劑組（VEH，n=6）：正常飲食和飲水，裝有5％甲醇的滲透泵。③螺內(nèi)酯組（SPI，n=6）：正常飲食和飲水的基礎(chǔ)上，每天以25 mg/kg灌胃。④醛固酮組（ALD，n=6）：正常飲食和飲水，將裝有溶解在5％甲醇的醛固酮的滲透泵，埋于大鼠腹背部皮下。⑤醛固酮+螺內(nèi)酯組（ALD+SPI，n=6）：正常攝食基礎(chǔ)上，皮下植入滲透泵，泵中裝有溶解在5％甲醇中的醛固酮。醛固酮（0.75μg/h）或僅5％甲醇經(jīng)微量滲透泵

7、持續(xù)皮下恒流輸注。螺內(nèi)酯（25 mg/kg/day）經(jīng)灌胃。
　　3、測量血漿醛固酮濃度：模型制備后，于實驗前，取SD大鼠的動脈血液1.5-2 ml。離心機以1000 g離心15分鐘，去出上清液，放置-80℃保存。使用大鼠醛固酮試劑盒測量大鼠血漿內(nèi)醛固酮的濃度。
　　4、血壓和心率的測量：用20％的烏拉坦5 ml/kg腹腔麻醉，使用股動脈插管技術(shù)，測量血壓和心率，每只動物測量3次，取其收縮壓的平均值作為基礎(chǔ)值。
　　5

8、、動脈壓力反射敏感性測定：各組動物于4周后，參照文獻按照改良的Smyth方法進行動脈壓力反射敏感性檢測。股靜脈插管，通過股靜脈給藥，注射硝普鈉（SNP）和苯腎上腺素（PE）分別誘發(fā)升壓反射和降壓反射，以反射前后的收縮壓變化值與心動周期變化值之比（ΔSBP/ΔCC）作為升壓反射敏感性（BRS-SNP）和降壓反射敏感性（BRS-PE）指標。
　　6、取五組大鼠的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)（NG），采用免疫組織化學技術(shù)檢測 ENaC-β、ENaC-γ的

9、表達，并使用ENaC-β、ENaC-γ與NeuN蛋白標志的免疫熒光共染色，鑒別ENaC-β、ENaC-γ在結(jié)狀神經(jīng)節(jié)（NG）中的分布。
　　7、4周后取五個組大鼠的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)（NG）組織，采用Western blot分別檢測脊結(jié)狀神經(jīng)節(jié)（NG）中的ENaC-β和ENaC-γ表達及變化。
　　8、統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差（mean±SD）表示，采用 GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析和t檢

10、驗，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.給醛固酮4周后，大鼠體內(nèi)醛固酮550.9±7.63 pg/ml，明顯高于對照組（193.2±4.95 pg/ml，P﹤0.001）。
　　2.升高醛固酮后，大鼠血壓（98.14±3.76mmHg）、心率（357.8±8.32 beat/min）、體重（412.7±7.65 g）與對照組相比（94.65±3.97 mmHg，345.7±11.59beta/min，

11、416.8±10.3 g），無明顯改變（P﹥0.05）。
　　3.醛固酮升高后，大鼠減壓反射敏感性（BRS）（0.225±0.05 ms/mmHg）比正常組（1.113±0.04）ms/mmHg）的明顯降低（P﹤0.001）。而醛固酮受體阻斷劑螺內(nèi)酯（0.973±0.05 ms/mmHg）可以阻斷醛固酮對 BRS的影響組，使之恢復近正常水平。
　　4.免疫熒光雙染確定ENaC-β和ENaC-γ蛋白在NenN標記的神經(jīng)元胞體（

12、結(jié)狀神經(jīng)節(jié)）處有表達。
　　5.通過滲透泵維持大鼠機體高醛固酮濃度，采用western blot檢測發(fā)現(xiàn)：醛固酮組的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中表達β/γENaC蛋白，正常組為100，ENaC-β和ENaC-γ蛋白的表達量分別為31.51±3.33和27.10±3.52（P﹤0.001）比正常組明顯減少，而醛固酮+螺內(nèi)酯合用組的β/γENaC的表達量分別為97.08±10.08和98.05±11.14（P﹥0.05）與正常組比較，基本恢復，表明醛