花椒麻素對試驗大鼠蛋白質(zhì)合成與分解代謝影響的機制研究.pdf

1、花椒（Z.bungeanum maxim）是我國及世界上部分國家重要的、較為廣泛食用的天然香辛料和中藥配料，其有效成分為花椒呈香和呈味成分。其中，花椒的呈味成分為花椒麻味物質(zhì)，也稱為花椒麻素，是一類存在于花椒中結(jié)構(gòu)獨特的重要活性成分（酰胺類物質(zhì)），具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎止痛以及抗血小板凝集等多種生理活性。近年來的研究表明，花椒麻素可促進體內(nèi)脂肪的氧化，減少脂肪沉積和血清中甘油三酯濃度的作用；另外，花椒麻素還可通過抑制糖異生作用，減少肝

2、糖的輸出，并能修復(fù)胰島功能，促進胰島素的分泌來改善鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)誘異的糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂。雖然花椒麻素對人體的功能作用已有一定的研究，但仍存在較多不明確的問題，尤其是對體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解代謝方面的作用等方面研究甚少。現(xiàn)有研究表明，蛋白質(zhì)合成代謝及分解代謝作用都依賴于mTOR途徑，這意味著mTOR可能作為蛋白質(zhì)合成與分解過程的交叉位點，通過對下游分子的表達調(diào)控，起到調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的作用。而mTOR的

3、活化受上游多個信號通路(受營養(yǎng)因子、生長因子、能量)所介導(dǎo)，其中腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)可負(fù)向調(diào)控 mTOR。泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin–proteasome pathway，UPP)通過三酶級聯(lián)反應(yīng)將泛素連接于靶蛋白使其泛素化，介導(dǎo)了真核生物80%-85%的蛋白降解。然而花椒麻素對機體蛋白質(zhì)合成和分解代謝的影響如何？以何種刺激信號(營養(yǎng)因子、生長因子、能量等

4、)去影響？等均不清楚。因此，本實驗運用大鼠動物在體實驗，采用qPCR和western-blot等技術(shù)從核酸水平和蛋白水平探明花椒麻素對不同體質(zhì)（健康、糖尿病-Ⅰ型）大鼠個體的機體內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝的mTOR途徑、AMPK途徑和分解代謝的UPP途徑的影響，最終明確花椒麻素對機體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解代謝的影響及機制，并建立起一套研究生物活性物質(zhì)對蛋白質(zhì)代謝影響分子機制的技術(shù)與方法體系。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴花椒麻素對健康SD試驗大鼠

5、機體蛋白質(zhì)代謝的影響研究。將32只健康 SD雄性大鼠按體重隨機分為空白對照組(Control)，花椒麻素的大豆油溶液高劑量灌胃試驗組8mg/(kg.d)(HDG)、中劑量灌胃試驗組4mg/(kg.d)(MDG)和低劑量灌胃試驗組2mg/(kg.d)(LDG)，每組各8只，試驗期為28天。實驗結(jié)束后，測定試驗大鼠血清、肝臟、骨骼肌和空腸等組織中與機體蛋白質(zhì)代謝直接相關(guān)的生理生化指標(biāo)、代謝酶的活性和激素的水平等的變化；qPCR檢測其骨骼肌中

6、肌細胞生成素(myogenin, MyOG)、肌肉生長抑制素(myostatin, MSTN)、鈣蛋白酶-1(μ-calpain, CAPN-1)、鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin, CAST)的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，以探討花椒麻素對健康SD試驗大鼠機體蛋白質(zhì)代謝的影響。實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，花椒麻素可顯著(P＜0.05)提高大鼠相對骨骼肌的重量，可顯著(P＜0.05)降低腹脂率，但對其它臟器的相對重量影響不顯著(P＞0

7、.05)；顯著(P＜0.05)增加試驗大鼠血清中總蛋白、白蛋白和球蛋白的含量，但對白蛋白/球蛋白比值的影響不顯著(P＞0.05)；顯著(P＜0.05)降低試驗大鼠血尿氮(BUN)的含量，但對大鼠血清Cr含量的影響不顯著(P＞0.05)；顯著(P＜0.05)升高血清中三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine, T3)和胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor-1, IGF-I)的含量，但對血清中甲

8、狀腺素(thyroxine, T4)，白細胞介素6(interleukin, IL-6)和胰島素（insulin, Ins)的影響不顯著(P＞0.05)；中、高劑量試驗組的花椒麻素可顯著(P＜0.05)提高大鼠空腸刷狀緣γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase,γ-GT)活性和空腸氨肽酶 N(aminopeptidase N, APN)活性(P＜0.05)，但對空腸羧肽酶 A(Carboxypeptidase, CP

9、A)和二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ, DPP-Ⅳ)活性的影響不顯著(P＞0.05)；顯著(P＜0.05)升高試驗大鼠骨骼肌中RNA的含量(P＜0.05)，而對大鼠骨骼肌中DNA含量無顯著影響(P＞0.05)，高劑量試驗組和中劑量試驗組顯著(P＜0.05)提高骨骼肌中RNA/DNA比值。此外，花椒麻素可顯著(P＜0.05)上調(diào)大鼠骨骼肌中IGF-Ⅰ、MyOG、CAPN-1和CAST mRNA表達量，顯著(P

10、＜0.05)下調(diào)MSTN mRNA表達量。結(jié)果提示：灌胃適當(dāng)劑量的花椒麻素可顯著增加試驗大鼠的相對骨骼肌重，減少腹脂的沉積；顯著降低體重；說明花椒麻可通過調(diào)節(jié)能量分配來改變試驗大鼠胴體的組成。適當(dāng)劑量的花椒麻素可顯著提高試驗大鼠血清總蛋白的含量，顯著增強肝臟中GPT的活性，促進機體蛋質(zhì)的合成代謝。另外，花椒麻素可通過上調(diào)MyOG mRNA表達量的同時下調(diào)抑制基因MSTN mRNA表達量，促進骨骼肌的生長；可由CAPN-1/CAST系統(tǒng)增

11、強骨骼肌蛋白質(zhì)的更新，并促進蛋白質(zhì)的沉積。其中，高劑量試驗組和中劑量試驗組促進機體蛋白質(zhì)沉積的效果比低劑量試驗組顯著(P＜0.05)。
　?、苹ń仿樗貙】礢D試驗大鼠氨基酸及氨基酸轉(zhuǎn)運載體影響的研究。實驗結(jié)束后，測定試驗大鼠血清、肝臟、骨骼肌及空腸中15種氨基酸的含量；應(yīng)用 qPCR檢測空腸、骨骼肌、肝臟中相應(yīng)氨基酸轉(zhuǎn)運載體的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，以探討氨基酸及氨基酸轉(zhuǎn)運載體是否為花椒麻素對健康 SD試驗大鼠蛋白質(zhì)沉積的信號因子。

12、結(jié)果表明，與空白對照組相比，花椒麻素可顯著(P＜0.05)升高試驗大鼠血清和骨骼肌中Asp、Glu、Asn、Arg、Ser和Ala含量；顯著(P＜0.05)降低試驗大鼠血清中Gln含量；顯著(P＜0.05)增加骨骼肌和空腸組織中Gln含量；肝臟中Gln含量有增加趨勢，但不顯著(P＞0.05)?；ń仿樗貙υ囼灤笫蠊趋兰≈蠦CAA的影響主要表現(xiàn)為降低其含量，其中高劑量試驗組和中劑量試驗組可顯著(P＜0.05)降低骨骼肌Ile的含量(P＜0.

13、05)?；ń仿樗乜娠@著(P＜0.05)上調(diào)試驗大鼠空腸PepT1、ECAA1、ASCT1和PAT1 mRNA表達量；顯著(P＜0.05)下調(diào)試驗大鼠空腸CAT-1、y+LAT1、b0,+AT mRNA表達量，但對ATB0,+的影響不顯著(P＞0.05)。顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗大鼠肝臟PepT1、ASCT1和ECAA1 mRNA表達量；顯著(P＜0.05)上調(diào)骨骼肌PAT1 mRNA表達量，顯著(P＜0.05)下調(diào)ATF4、CD98

14、和y+LAT1 mRNA表達量。結(jié)果提示：花椒麻素升高試驗大鼠血清和骨骼肌中的生糖氨基酸，其主要來源于機體內(nèi)相應(yīng)α-酮酸自身合成導(dǎo)致。其中，高劑量試驗組和中劑量試驗組升高試驗大鼠血清和骨骼肌中生糖氨基酸效果顯著高于低劑量試驗組(P＜0.05)。綜合以上結(jié)果可知，氨基酸和氨基酸轉(zhuǎn)運載體并非花椒麻素影響試驗大鼠蛋白質(zhì)沉積的信號因子。
　　⑶花椒麻素對健康SD試驗大鼠蛋白質(zhì)合成與分解代謝影響的機制研究。實驗結(jié)束后，采用實時熒光定量及其蛋

15、白免疫印跡技術(shù)檢測試驗大鼠肝臟及骨骼肌中與蛋白質(zhì)合成與分解代謝的相關(guān)基因mRNA及其蛋白表達量，以進一步探討花椒麻素對健康SD試驗大鼠蛋白質(zhì)合成與分解代謝影響的機制。結(jié)果表明，與空白對照組相比，花椒麻素可顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗大鼠肝臟中IGF-I、mTOR、PI3K和PKB mRNA表達量，顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗大鼠肝臟的mTOR, p-mTOR(Ser2448)、PI3K(p110)、PKB和p-PKB(Ser437)蛋白

16、水平；顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗大鼠骨骼肌IGF-I、mTOR、PI3K、PKB、TSC2 mRNA的表達量，顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗大鼠骨骼肌mTOR, p-mTOR(Ser2448)、PI3K(p110)、PKB、p-PKB(Ser437)和TSC2蛋白水平，而對AMPK、p-AMPK(Thr172)和TSC1蛋白水平影響不顯著（P＞0.05）。另外，灌胃花椒麻素可顯著(P＜0.05)下調(diào)試驗大鼠骨骼肌atrogin-1/MA

17、Fbx、MuRF1、FoxO1、FoxO3和FoxO4 mRNA的表達量和蛋白水平。結(jié)果提示：花椒麻素對健康SD試驗大鼠骨骼肌中AMPK途徑的影響不顯著(P＞0.05)；可通過IGF-I→PI3K→PKB→mTOR途徑增加機體蛋白質(zhì)合成，并通過UPP途徑減少蛋白質(zhì)的分解。
　?、然ń仿樗貙TZ誘導(dǎo)的糖尿病試驗大鼠蛋白質(zhì)代謝的影響和機制研究。以40只雄性糖尿病試驗大鼠為研究對象，并隨機分為空白對照組(Control)，模型對照組（

18、DM），高劑量灌胃8mg/(kg.d)(DM-HD)試驗組、中劑量灌胃4mg/(kg.d)(DM-MD)試驗組和低劑量灌胃2mg/(kg.d)(DM-LD)試驗組，每組各8只，連續(xù)灌胃28 d。實驗結(jié)束后，測定糖尿病試驗大鼠血清、肝臟、骨骼肌和空腸等組織中與機體蛋白質(zhì)代謝直接相關(guān)的生理生化指標(biāo)、代謝酶的酶活和激素水平等的含量與變化；并采用qPCR和western-blot等技術(shù)檢測大鼠肝臟及骨骼肌中與蛋白質(zhì)合成與分解代謝相關(guān)基因mRNA

19、及蛋白表達量，來探討花椒麻素對蛋白質(zhì)代謝紊亂的糖尿病試驗大鼠的蛋白質(zhì)代謝影響與機制，以進一步闡明花椒麻素對試驗大鼠蛋白質(zhì)代謝的影響與機制。結(jié)果表明，花椒麻素可顯著(P＜0.05)降低糖尿病試驗大鼠空腹血糖和果糖胺的含量，可緩解因糖尿病誘導(dǎo)的臟器腫大；顯著(P＜0.05)增加骨骼肌重量，顯著(P＜0.05)升高血清胰島素、IGF-I、總蛋白、白蛋白含量及球蛋白/白蛋白比值。顯著(P＜0.05)增加骨骼肌總蛋白、RNA含量及RNA/DNA比

20、值；可顯著(P＜0.05)上調(diào)肝臟和骨骼肌IGF-I，IGF-IR和InR mRNA表達量；顯著(P＜0.05)上調(diào)骨骼肌PI3K、PKB和mTOR mRNA表達量；顯著(P＜0.05)下調(diào)骨骼肌atrogin-1/MAFbx、MURF1和FoxO mRNA表達量；顯著(P＜0.05)上調(diào)骨骼肌mTOR(total)、p-mTOR(ser2448、PKB(total)、p-PKB(ser437)和 PI3K(p110)蛋白水平；顯著(P

21、＜0.05)下調(diào)骨骼肌中atrogin-1/MAFbx、MURF1和 FoxO蛋白表達量。結(jié)果提示：花椒麻素可改善因STZ誘導(dǎo)所致糖尿病大鼠機體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂，其中高劑量試驗組和中劑量試驗組改善糖尿病大鼠機體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂的效果顯著(P＜0.05)好于低劑量試驗組。其機制可能為：花椒麻素可由 Ins/IGF-I→PI3K→PKB→mTOR信號通路增加糖尿病試驗大鼠蛋白質(zhì)合成，并通過UPP途徑降低蛋白質(zhì)的分解。
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22、糖尿病大鼠骨骼肌AMPK途徑的影響研究。實驗結(jié)束后，測定糖尿病試驗大鼠血清和肝臟中TG(triglyceride)、MDA(malondialdehyde)、TC(total cholesterol)和FFA(free fatty acid)含量及變化；并采用 qPCR和 western-blot檢測糖尿病試驗大鼠骨骼肌中AMPK、SIRT1、ACC、GLUT4等相關(guān)基因mRNA及蛋白表達量，以探討花椒麻素對糖尿病大鼠骨骼肌AMPK途徑

23、的影響及潛在機制。結(jié)果表明，花椒麻素可顯著(P＜0.05)降低糖尿病試驗大鼠血清中 TG、MDA和FFA含量，顯著(P＜0.05)降低肝臟的TC、TG和MDA的含量。 qPCR和western-blot檢測表明，花椒麻素對糖尿病試驗大鼠骨骼肌AMPK mRNA有上調(diào)趨勢，但不顯著(P＞0.05)；但顯著(P＜0.05)上調(diào)AMPK和p-AMPK(Thr172)蛋白質(zhì)表達，顯著(P＜0.05)上調(diào)ACC mRNA表達和p-ACC(Ser7

24、9)蛋白質(zhì)表達，同時顯著(P＜0.05)上調(diào)糖尿病大鼠骨骼肌細胞膜上GLUT4 mRNA和蛋白表達。結(jié)果提示：花椒麻素可激活糖尿病大鼠骨骼肌 AMPK信號通路，抑制 ACC活性減少脂肪酸的形成；同時通過激活A(yù)MPK信號通路介導(dǎo)GLUT4快速轉(zhuǎn)位，提高葡萄糖轉(zhuǎn)運速率，降低血糖。因此，花椒麻素可通過激活A(yù)MPK途徑，改善糖尿病大鼠糖、脂及蛋白質(zhì)代謝紊亂?；ń仿樗貙μ悄虿〈笫蠊趋兰〉鞍踪|(zhì)合成增加是 Ins/IGF-I→PI3K→PKB途徑和A