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文檔簡介
1、研究背景:
膿毒癥是嚴重創(chuàng)(燒)傷、休克、外科大手術(shù)后常見的并發(fā)癥,來勢兇險,病情演變很快,常并發(fā)多器官功能障礙綜合癥(MODS),有極高病死率。負氮平衡為膿毒癥狀態(tài)機體代謝的典型特征,占機體細胞干重50%的骨骼肌蛋白的高分解代謝是其主要原因之一。
膿毒癥狀態(tài)下骨胳肌蛋白高分解代謝涉及一個錯綜復雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡。泛素系統(tǒng)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白降解途徑,在機體代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。研究認為膿毒癥大鼠骨骼肌蛋白
2、高分解代謝與泛素-蛋白酶系統(tǒng)密切相關(guān)。膿毒癥時機體釋放多種因子(生長因子,白介素家族因子,腫瘤壞死因子等),能直接或間接誘導泛素系統(tǒng)激活,影響骨骼肌蛋白降解率。白介素-15(IL-15)具有廣泛的生物學活性,在骨骼肌中高表達。研究表明IL-15能夠明顯逆轉(zhuǎn)腫瘤惡病質(zhì)小鼠模型骨骼肌重量下降趨勢,并能夠下調(diào)泛素(Ub)活性,影響蛋白質(zhì)降解。目前關(guān)于IL-15對膿毒癥狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)分解代謝影響的研究罕見,機制尚不清楚。研究認為TNF-α能
3、夠明顯增強泛素系統(tǒng)的表達及活性,促進骨骼肌蛋白降解。相關(guān)研究也提示IL-15和TNF-α的釋放與活性存在著相互作用,IL-15對泛素-蛋白酶途徑的影響可能由TNFα介導,也可能是由IL-15直接作用于泛素-蛋白酶途徑,其具體作用機制有待進一步明確。
研究目的:
基于以上研究結(jié)果,本課題試圖通過動物實驗,擬進一步描述、探討膿毒癥狀態(tài)下機體骨骼肌蛋白降解規(guī)律、IL-15、泛素系統(tǒng)蛋白及基因的表達水平變化情況和互相
4、作用機制。摸索外源性IL-15干預的最佳時間點及劑量。提出假設(shè):外源性IL-15干預能下調(diào)機體膿毒癥骨骼肌蛋白質(zhì)降解率,為膿毒癥高代謝惡病質(zhì)的防治探索新的途徑。
實驗方法:
1.用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立穩(wěn)定的膿毒癥大鼠模型:CLP術(shù)后觀察大鼠一般生命體征參數(shù),各臟器損傷程度,觀察模型是否建立穩(wěn)定。
2.健康SD大鼠隨機分為CLP組(A組)、假手術(shù)對照組(B組)。于觀察時間點(2h、4h、8
5、h、12h、24h)活殺大鼠離體孵育伸趾長肌,高效液相質(zhì)譜法測定總蛋白(Tyr)和肌纖維蛋白(3-MH)降解率;取血液、骨骼肌和臟器,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、組織芯片免疫組織化學染色法(IH)和實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析Ub和IL-15的基因和蛋白表達變化規(guī)律。
3.外源性IL-15干預的時間及劑量摸索:根據(jù)前期研究結(jié)果,選擇CLP術(shù)后8小時為時間效應點。CLP術(shù)后6h(C組)、7.5h(
6、D組)、8h(E組)外源性IL-15干預組于干預時間點大鼠尾靜脈注射高純度重組鼠IL-15(100μg/Kg),其余時間點及非干預組(F組)注射相同劑量生理鹽水。于12h活殺取標本,分析指標變化。求IL-15干預的最佳時間點(T0)。
4.外源性IL-15干預:膿毒癥大鼠(CLP術(shù)后)分為2組,對照組(G組)在T0(CLP術(shù)后Th)尾靜脈注射生理鹽水;干預組(H組)大鼠在T0尾靜脈注射高純度重組IL-15,劑量為M0,分析
7、指標差異。
5.TNFα單克隆抗體干預:對照組(I組)單純給予外源性IL-15干預,于CLP后2h及8h予以生理鹽水注射。外源性IL-15+TNFα單抗干預組(J組):在CLP后7h尾靜脈注射重組IL-15同時,于CLP后2h及8h,分兩次尾靜脈注射TNFα單抗(3mg/kg)。分析指標差異。
實驗結(jié)果及討論:
1.采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立膿毒癥大鼠模型。術(shù)后隨時間延長,CLP組大鼠一般
8、狀態(tài)惡化,血漿中內(nèi)毒素水平進行性增高。對照組參數(shù)穩(wěn)定。兩組比較差異顯著(P<0.01)。病理光鏡顯示CLP術(shù)后大鼠肝臟、腎臟細胞壞死、核裂解,骨骼肌細胞斷裂。
2.A組膿毒癥大鼠CLP術(shù)后血漿、組織內(nèi)IL-15和泛素的蛋白及m RNA總體表達水平高于B組(P<0.01),均先升高后期有所下降。較之B組,A組大鼠CLP術(shù)后血清IL-15蛋白于術(shù)后8h達最高峰后下降;骨骼肌中IL-15和Ub m RNA水平于術(shù)后4h增高,12
9、h至高峰;骨骼肌蛋白代謝率隨時間延長進行性增高(P<0.01),24h達最高峰。推斷CLP術(shù)后8h為有效代償時間窗,確定為時間效應點。
3.摸索性外源性IL-15干預實驗中,較F組,C組、D組、E組大鼠骨骼肌代謝率降低,血清IL-15濃度升高,血清Ub濃度降低(P<0.01),推斷最佳干預時間點(T0)為CLP后7h。骨骼肌肌纖維蛋白代謝率與血清IL-15濃度呈負相關(guān)(r=-0.41374,P<0.05),與Ub濃度呈正相
10、關(guān)(r=0.76247,P<0.01)。
4.外源性重組IL-15細胞因子干預實驗中,較G組,H組蛋白代謝率明顯降低(P<0.01),H組血漿、組織中IL-15蛋白表達升高(P<0.05)。說明IL-15能有效拮抗骨骼肌蛋白的降解效應。
5.兩組血漿組織中IL-15和Ub表達水平差異有顯著性(P<0.01),I組骨骼肌肌纖維蛋白代謝率較J組低(P<0.01),但是骨骼肌總蛋白代謝率無統(tǒng)計學差異。說明IL-15
11、對泛素-蛋白酶途徑的影響可能由TNF-α介導,但不是唯一通路。提示骨骼肌細胞存在IL-15特異受體。
小結(jié):
本研究建立了穩(wěn)定的①膿毒癥大鼠模型;②體外骨骼肌有氧孵育系統(tǒng);③高效液相-質(zhì)譜法檢測三甲基組氨酸和酪氨酸的方法;④分析IL-15和泛素系統(tǒng)基因和蛋白表達的方法與條件。
實驗結(jié)果描述了膿毒癥病理狀態(tài)下,機體IL-15和泛素基因、蛋白水平的表達規(guī)律,觀察到膿毒癥時IL-15和Ub的表達與骨骼
12、肌的代謝率相關(guān)。病理狀態(tài)下IL-15的轉(zhuǎn)錄翻譯被激活。通過外源性重組IL-15因子的干預,初步摸索了IL-15干預的時間點(CLP后7h)和劑量(100μg/Kg)。實驗顯示IL-15干預能降低膿毒癥骨骼肌蛋白代謝率,推測CLP后7h為最佳干預時間點。通過TNF-a阻斷劑干預,認為IL-15對Ub系統(tǒng)的影響可能由TNF-α介導,但不是唯一通路。在危重病狀態(tài)下,內(nèi)源性IL-15的合成遠不能滿足機體的消耗,刺激合成以及外源性的補充十分必要。
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