CRISPR-Cas9介導(dǎo)hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位點定點整合研究.pdf

1、本研究利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)，將無抗性無標記基因的hFAD3基因表達盒定點敲入牛NCAPG-LCORL位點，研究hFAD3基因的表達對脂肪酸含量，位點旁側(cè)基因以及脂肪酸相關(guān)基因表達的影響，獲得定點整合陽性單克隆細胞的效率，同時比較有無MAR序列介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細胞中hFAD3基因的表達量，結(jié)果如下:
　　1.針對牛NCAPG-LCORL位點成功構(gòu)建了Cas9切割載體:pCas Guide-B。利用人工合成人源化hFAD3基因，成

2、功構(gòu)建了5種hFAD3基因定點整合載體:C2(5'arm-CAG-hFAD3-PolyA-3'arm)、M2(5'arm-MAR-CAG-hFAD3-PolyA-MAR-3'arm)、P2(pGT-C1-LHA-RHA-hFAD3)、C22(LHA-CAG-hFAD3-PolyA-3'arm)和CRL(LHA-CAG-hFAD3-PolyA-RHA)。
　　2.對轉(zhuǎn)染后細胞DNA、RNA、脂肪酸水平進行分析。1）PCR鑒定及測序結(jié)

3、果表明，實現(xiàn)了多種hFAD3基因定點整合載體在牛NCAPG-LCORL位點的定點整合。2）外源基因hFAD3在RNA水平正常表達。3）Real-time quantitativePCR結(jié)果表明hFAD3基因整合后，使得位點上游NCAPG基因表達量上調(diào)，下游LCORL基因表達量下調(diào)。4）運用氣相質(zhì)譜儀對轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因細胞及其培養(yǎng)液的脂肪酸含量進行分析。結(jié)果表明，hFAD3轉(zhuǎn)基因細胞中ω6/ω3 PUFAs比值(0.565)較非轉(zhuǎn)基因細胞

4、(1.549)顯著下降(P＜0.01);轉(zhuǎn)基因細胞培養(yǎng)液中ω6/ω3 PUFAs比值(0.623)較非轉(zhuǎn)基因細胞培養(yǎng)液(0.848)顯著下降(P＜0.05)。5) Real-time quantitative PCR結(jié)果表明，hFAD3基因表達后，脂肪酸分解相關(guān)基因(PPARg、LIFE、LPL)表達量總上調(diào)倍數(shù)大于脂肪酸合成相關(guān)基因(ACC、SCD、FASN)，說明hFAD3基因的表達使得細胞內(nèi)的脂肪趨于分解。
　　3.通過流式

5、分選以及無限稀釋法篩選陽性單克隆細胞。gB+C2實驗組共獲得59株單克隆細胞，經(jīng)PCR及測序鑒定，其中定點整合陽性單克隆細胞3株，定點整合效率為5.1％。同時檢測單克隆細胞株脂肪酸的含量與位點旁側(cè)基因和脂肪相關(guān)基因的表達量，結(jié)果與轉(zhuǎn)染后細胞一致。
　　4.比較有無MAR序列介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因細胞中hFAD3基因的表達量，MAR介導(dǎo)組是無MAR介導(dǎo)組的5.91倍(p＜0.01)。
　　綜上所述，利用CRISPR/Cas9技術(shù)可實現(xiàn)h