與心肌細胞體外共培養(yǎng)誘導骨髓基質細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：骨髓基質細胞(BMSCs)是一種骨髓來源的具有多向分化潛能的成體干細胞。它在一定條件下可以向多種結締組織及部分來源于外胚層的組織分化，能形成骨、軟骨、骨骼肌、神經(jīng)細胞、脂肪細胞等。缺血性心臟病是一種嚴重危害人類健康的常見疾病，可導致心肌梗塞，最終誘發(fā)心力衰竭。現(xiàn)有的治療方法只能部分改善心肌的缺血情況，防止進一步的心肌損害，并不能修復受損心肌，使已有心肌病變逆轉，所以移植成肌細胞進入心肌組織形成新的心肌修復受損心肌受到廣泛關注。隨著

2、細胞培養(yǎng)和分子生物學的發(fā)展，細胞移植治療心肌梗死和心力衰竭成為可能。由于自體骨髓基質細胞無移植后免疫排斥反應，且細胞在體外有良好增殖能力，并能在適宜條件誘導下分化為損傷組織所需要的細胞，因而在心肌損傷的治療中備受重視。研究表明5-氮胞苷(5-aza)可以作為體外的化學誘導劑使BMSCs向心肌細胞方向分化，但是有實驗發(fā)現(xiàn)5-aza作為一種化學物質，在誘導分化的同時對細胞也具有一定毒性作用。同時心肌樣微環(huán)境作為能使BMSCs向心肌細胞定向分

3、化的另一因素越來越受到重視。有人提出體內微環(huán)境中有許多因素參與干細胞的分化，主要有化學因素和物理因素，前者是指細胞因子等，后者主要是指細胞與細胞間的相互作用，如縫隙連接、電刺激、收縮等。實驗證明BMSCs無論異體移植、自體移植對心肌梗死后心功能的改善均有一定的作用。本實驗采用BMSCs與心肌細胞體外共培養(yǎng)模擬心肌樣微環(huán)境誘導BMSCs分化，應用免疫細胞化學、激光共聚焦顯微鏡觀察、熒光顯微鏡觀察等方法，探討B(tài)MSCs誘導分化成心肌細胞與心

4、肌樣微環(huán)境的關系。 方法： 1.骨髓基質細胞的培養(yǎng)取出生2-3周的SD大鼠乳鼠，用水合氯醛麻醉、75％酒精消毒后，取股骨、脛骨骨髓，采用貼壁細胞分離法分離BMSCs，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。 2.心肌細胞培養(yǎng)取出生1-5天的SD大鼠乳鼠，75％酒精消毒，開胸取心室肌剪成1mm3小塊，用胰蛋白酶和膠原酶消化后，將細胞以105/ml接種于培養(yǎng)瓶中放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 3.骨髓基

5、質細胞與心肌細胞共培養(yǎng)將第三代的BMSCs從培養(yǎng)瓶消化解離，以103/ml的密度加入心肌細胞中，搖勻后進行共培養(yǎng)。取其中一部分BMSCs，于共培養(yǎng)前24小時先用DAPI標記2小時，用于進行免疫熒光檢測。 4.免疫細胞化學檢驗骨髓基質細胞與心肌細胞共培養(yǎng)的第4天、第8天、第16天分別取出細胞爬片各為一組，單獨培養(yǎng)的BMSCs作為對照組，用4％多聚甲醛固定后每組分別進行α-Actin、TnT抗體免疫細胞化學染色。 5.激光掃

6、描共聚焦顯微鏡觀察三組實驗組和對照組細胞中首先加CD44作為第一個一抗，過夜，每組再分別加入α-Actin、TnT作為第二個一抗，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察抗體表達。 6.熒光顯微鏡觀察將用DAPI標記過的BMSCs與心肌細胞共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)的第4天、第8天、第16天分別取出細胞爬片，各為一組，單獨培養(yǎng)的BMSCs作為對照組，用4％多聚甲醛固定后，每組分別進行α-Actin、TnT抗體檢測。用熒光顯微鏡觀察實驗結果。 結

7、論： 1.免疫細胞化學染色共培養(yǎng)第4天、第8天、第16天三組細胞中α-Actin、TnT均有表達，對照組α-Actin與TnT均陰性表達，說明共培養(yǎng)可誘導BMSCs分化表達心肌特異性抗體。其中共培養(yǎng)第8天BMSCs陽性表達的細胞數(shù)量最多，α-Actin與TnT陽性表達率最強，至共培養(yǎng)第16天，α-Actin與TnT陽性表達率比共培養(yǎng)第8天有所下降。 2.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察CD44是BMSCs一種表面分子，細胞CD4