體外誘導人胚胎生殖細胞向心肌細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的： 1．探討維甲酸(RA)、參麥、抗壞血酸作為誘導劑誘導人胚胎生殖細胞(EG細胞)體外分化為心肌細胞的可行性； 2．觀察人胚胎生殖細胞經(jīng)三種誘導劑誘導不同時間后的分化狀態(tài)； 3．尋求能使人胚胎生殖細胞體外分化為心肌細胞的更安全可靠且高效的誘導劑。 方法： 取5-10周流產(chǎn)人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜，進行組織塊培養(yǎng)。以源于自身胚胎組織的成纖維細胞作為飼養(yǎng)層，在培養(yǎng)液中添加白血病抑制因子(LIF)

2、，觀察人EG細胞生長及集落形成情況。將培養(yǎng)得到的細胞消化成單細胞懸液，差速貼壁1h去除成纖維細胞(MEF)，細胞計數(shù)后以1×10 5/ml的初始密度接種于100mm的培養(yǎng)皿進行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)液中去除了LIF。培養(yǎng)5天后，小心挑出類胚體(EBs)接種于24孔板中，然后分別添加含不同濃度RA、參麥、抗壞血酸的誘導液進行誘導分化培養(yǎng)，觀察細胞的分化狀態(tài)。取誘導不同時間(1周、2周、3周、4周)后的細胞做免疫細胞化學染色，鑒定誘導后細胞心肌特異

3、轉(zhuǎn)錄因子GAZA-4和心肌肌鈣蛋白T(eTnT)的表達情況。用統(tǒng)計學方法計算人EG細胞經(jīng)三種誘導劑誘導后的心肌樣細胞轉(zhuǎn)化率，從而找出各種誘導劑的最佳誘導濃度，并比較三種誘導劑的誘導效果。 結(jié)果： 經(jīng)RA、參麥、抗壞血酸三種誘導劑誘導1周后，EBs周邊長出的細胞呈梭形或不規(guī)則形；誘導2周，細胞之間的突起相互連接；誘導3周，細胞之間的連接更加緊密，可見幾個細胞連接形成閏盤樣結(jié)構(gòu)；誘導4周，細胞呈條索狀排列，走向趨于一致。誘導

4、l周后細胞即出現(xiàn)GAIA-4弱表達，核呈棕黃色，數(shù)量較少；誘導2周，陽性細胞數(shù)量增多且顏色加深，核橢圓形，染成棕色；誘導3周GATA-4的表達達高峰，核長橢圓形染色為棕褐色；誘導4周，陽性細胞數(shù)量較3周時減少且顏色變淡。誘導2周cTnT開始有弱表達，胞漿染成淺棕色；誘導3周，cTnT的表達增強，胞漿內(nèi)出現(xiàn)橫紋樣陽性結(jié)構(gòu)，但主要分布于核周區(qū)，染色為棕色；誘導4周，胞漿陽性反應產(chǎn)物明顯增強且分布廣泛，染色為棕褐色。對照組GATA-4和cTn

5、T陰性表達。RA誘導人EG細胞向心肌細胞分化的最佳誘導濃度為10-8mol/l或10-9mol/l，誘導效率最高達(81.7±0.41)％;參麥的最佳誘導濃度為1 g/l，誘導效率最高達(57.0±3.25)％；抗壞血酸的最佳誘導濃度為0.1mg/ml，誘導分化率最高達(85.2±1.79)％。 結(jié)論： RA、參麥和抗壞血酸三種誘導劑均能誘導人EG細胞向心肌細胞分化，誘導后的細胞GATA-4和cTnT陽性表達?？箟难岷?/p>