羊水間充質(zhì)干細(xì)胞體外聯(lián)合誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的效果研究.pdf

1、背景及目的:
　　目前，再灌注治療成為急性心肌梗死的重要治療方法，然而大量臨床病歷顯示，缺血后瀕危心肌恢復(fù)血供反而會(huì)加重心肌損傷，如何使損傷壞死心肌得到修復(fù)已成為當(dāng)前一項(xiàng)重要的研究內(nèi)容，也是今后心血管研究的發(fā)展趨勢(shì)之一。近年來，伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及干細(xì)胞研究的突破性進(jìn)展，為冠心病、心梗及缺血再灌注損傷的防治帶來了新的希望。
　　通過特定的分化步驟，間充質(zhì)干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化為多種成熟的靶細(xì)胞，已經(jīng)成為了公認(rèn)的成人干細(xì)

2、胞移植的來源之一，并被用于多種研究，包括心肌梗死后再修復(fù)，同時(shí)顯示出提高急性或慢性心肌缺血的患者心肌再灌注和心功能的能力。然而從骨髓、胚胎或者成體組織中分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞存在很多缺點(diǎn)，因此尋找新的優(yōu)良干細(xì)胞成為了細(xì)胞治療研究的焦點(diǎn)。羊水間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種新的優(yōu)良種子細(xì)胞，為心肌的修復(fù)和再生帶來了新的希望。
　　關(guān)于羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究目前還處于起步階段，國內(nèi)外相關(guān)的研究不多。因此，如何高效地使羊水間充質(zhì)干細(xì)胞定向分

3、化為心肌細(xì)胞成為了心血管再生醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)之一。5-氮胞苷可以促進(jìn)心肌細(xì)胞肌小節(jié)的生成，還可以促進(jìn)心肌細(xì)胞特有的肌球蛋白和肌間蛋白的生成，轉(zhuǎn)錄生長因子β1是多功能生長因子家族，與增殖、分化和死亡等多種細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)，在干細(xì)胞自我更新、修復(fù)中起關(guān)鍵作用。本研究將改變傳統(tǒng)的誘導(dǎo)分化方法，嘗試采用5-氮胞苷和轉(zhuǎn)錄生長因子β1聯(lián)合誘導(dǎo)羊水間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分化，從而提高羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的分化效能。
　　方法:
　　根據(jù)前期成功分離培養(yǎng)羊

4、水間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，抽取懷孕16-18天的新西蘭白兔的羊水培養(yǎng)羊水間充質(zhì)干細(xì)胞，使用Western blot檢測(cè)干細(xì)胞全能基因OCT4的表達(dá)，取表達(dá)陽性細(xì)胞制成細(xì)胞懸液注射到BALB/C品系裸鼠皮下進(jìn)行致瘤實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，至少觀察8周。將干細(xì)胞全能基因OCT4表達(dá)陽性的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞分為A、B、C和D組，即A:對(duì)照組，B:轉(zhuǎn)錄生長因子β1誘導(dǎo)分化組，C:5-氮胞苷誘導(dǎo)分化組，D:5-氮胞苷與轉(zhuǎn)錄生長因子β1聯(lián)合誘導(dǎo)分化

5、組。A組不作處理，B組加入濃度為5ng/ml的轉(zhuǎn)錄生長因子β作用24小時(shí)，C組加入濃度為10μmol/L的5-氮胞苷作用24小時(shí)，D組加入濃度為5ng/ml的轉(zhuǎn)錄生長因子β1和濃度為10μmol/L的5-氮胞苷作用24小時(shí)后更換培養(yǎng)液，并分別在誘導(dǎo)后1、2、3和4周時(shí)，使用Real time PCR檢測(cè)心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA4的表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)心肌特異性肌鈣蛋白cTnT，western blot檢測(cè)縫隙連接蛋白Cx43，收集各項(xiàng)指標(biāo)表

6、達(dá)升高組的細(xì)胞，制作細(xì)胞切片，使用透射顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)檢測(cè)，羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的干細(xì)胞全能基因OCT4蛋白呈陽性表達(dá)。
　　2.致瘤實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的裸鼠8周后均正常生活，注射部位未見腫瘤形成。
　　3.培養(yǎng)的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞分組經(jīng)誘導(dǎo)分化后，A組細(xì)胞長勢(shì)無明顯變化，4周內(nèi)傳代6次后形態(tài)仍保持長梭形;B組細(xì)胞加入TGFβ1后生長增快，形態(tài)較A組伸長;C組加入5-氮胞苷后

7、細(xì)胞形態(tài)變長，部分融合;D組加入TGFβ1和5-氮胞苷后細(xì)胞部分融合，形態(tài)伸展變得粗大。
　　4.Real time PCR檢測(cè)各組心肌細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4的表達(dá):
　　A組在4周內(nèi)無明顯升高，B組在第4周時(shí)表達(dá)升高，C組在第3周時(shí)表達(dá)升高，D組在第2周時(shí)表達(dá)明顯升高，其中D組表達(dá)水平最高，與其余三組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞誘導(dǎo)分化后心肌肌鈣蛋白cTnT的表達(dá):
　　結(jié)果顯示

8、在第2周時(shí)A組只有極少量表達(dá)，B組和C組表達(dá)量略有增加，而D組心肌肌鈣蛋白cTnT表達(dá)水平明顯高于A組、B組和C組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞誘導(dǎo)分化后縫隙連接蛋白Cx43表達(dá):
　　在誘導(dǎo)分化后第2周時(shí)，A組只有極少量表達(dá)，B組和C組表達(dá)量略有增加，而D組縫隙連接蛋白Connexin43的表達(dá)比A組、B組和C組明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7.透射電鏡檢測(cè)各組細(xì)胞誘導(dǎo)分化后

9、的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化:
　　D組細(xì)胞可觀察到部分細(xì)胞有心肌細(xì)胞特異性的肌絲樣結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明:
　　1.采用我們的實(shí)驗(yàn)方法和條件分離出來的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞，干細(xì)胞全能基因OCT4蛋白呈陽性表達(dá)，結(jié)果表明羊水間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞。另外，本研究的致瘤實(shí)驗(yàn)證明羊水間充質(zhì)干細(xì)胞不具有致瘤性。
　　2.羊水間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化后的部分細(xì)胞中，心肌細(xì)胞特異性的GATA4、心肌肌鈣蛋白cTnT和