人類(lèi)Grb10基因和hPPB基因的克隆及功能研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物調(diào)節(jié)機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能的重要途徑。在生理情況下，細(xì)胞凋亡可能為默認(rèn)的途徑。細(xì)胞通過(guò)感受細(xì)胞因子和周?chē)h(huán)境的的刺激而使細(xì)胞脫離凋亡過(guò)程。該過(guò)程的障礙可能是退行性疾病和腫瘤發(fā)生的基本相關(guān)因素。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酵母雙雜交得到與線粒體凋亡途徑中重要功能分子him相互作用的蛋白GrblO。GrblO蛋白為生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白，是酪氨酸受體的分子伴侶，參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)節(jié)。其家族保守功能域包括N端的富含脯氨酸的區(qū)域，中間GM區(qū)

2、的RA結(jié)構(gòu)域和PH結(jié)構(gòu)域，以及C端的SH2結(jié)構(gòu)域。酵母雙雜交結(jié)果提示，GrblO可能參與bim介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路。我們對(duì)GrblO進(jìn)行全長(zhǎng)蛋白的基因克隆，GST融合蛋白的表達(dá)和純化，對(duì)其與bim進(jìn)行Pull—down和免疫共沉淀等體內(nèi)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，以及檢測(cè)細(xì)胞凋亡觀察GrblO對(duì)him功能的影響。Pull—down體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示GrblO與him有相互作用。細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示GrblO對(duì)bim過(guò)表達(dá)引起的凋亡有抑制作用。 在對(duì)A

3、D293和HEK293進(jìn)行差減雜交實(shí)驗(yàn)以探索兩者在黏附和凋亡特性的差異時(shí)，在AD293的高表達(dá)文庫(kù)里分離得到一段新的cDNA片段。我們從人類(lèi)胎腦文庫(kù)克隆得到該基因，全長(zhǎng)2745bp，編碼的蛋白含518個(gè)氨基酸，被預(yù)測(cè)為磷酸泛酰巰基乙胺結(jié)合蛋白一hPPB。該基因定位在2p22．3，包含8個(gè)外顯子。該cDNA序列編碼的蛋白序列含有一個(gè)凋亡抑制蛋白5結(jié)構(gòu)域，外皮蛋白重復(fù)片斷和銅結(jié)合辛肽重復(fù)片斷。RT一PCR分析顯示該基因在人類(lèi)正常組織和癌組織