人類RBBP10和bimα3的克隆和功能研究.pdf

1、細胞增殖和細胞凋亡是多細胞生物控制組織細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制.細胞周期和細胞凋亡異常是多種人類疾病的根本原因.RB及bcl-2家族蛋白為細胞周期和細胞凋亡的核心控制成分,它們各有其功能特點又彼此協(xié)調(diào).用RB口袋區(qū)結合蛋白保守功能域LxCxE和bcl-2凋亡關鍵功能域BH3 domain作為線索掃描新基因文庫,我們分離到了一個新的RB結合基因-RBBP10和2個新的bim異構體—bimα及bim β5.RBBP10編碼182個氨基酸,廣泛低表

2、達于多種人類組織,在腫瘤組織中表達水平較高.酵母雜交分析提示其具有和RB結合的能力,同時也可能與腫瘤標志蛋白Prx1及人類新基因yrdC產(chǎn)物相互結合.在HEK293細胞作正/反義過表達發(fā)現(xiàn),RBBP10和yrdC可能有正性調(diào)節(jié)細胞周期作用(反義過表達導致細胞增殖下降,對照:38.25±1.98﹪;RBBP10-:30.67±1.42﹪;yrdC-:33.53±1.00﹪),而Prx 1可能有負性調(diào)節(jié)細胞周期作用(正義過表達導致細胞增殖下

3、降,Prx 1+:30.95±1.63﹪).免疫組織化學研究發(fā)現(xiàn)RBBP10特異性表達于乳腺癌的癌巢腫瘤細胞而不表達于癌旁細胞,提示其可能是一個新的腫瘤標志基因.bimα3編碼79個氨基酸,在HEK293細胞其與bim L/S/α2有相似的亞細胞定位特性,過表達引起的細胞凋亡水平與bimα2相似(bimα2:30.14±2.66﹪;bim α3:32.05±6.42).提示BH3 domain為bim獲得線粒體定位及導致細胞凋亡的充要條

4、件.Bim β5 cDNA長349bp,用人工導入kozak序列的對比分析,鑒定了一個新的翻譯起始點,確定bim β5編碼36氨基酸且含BH3 domian.同時人工構建編碼28氨基酸且含BH3 domian的bim β6.轉(zhuǎn)染HEK293細胞可導致細胞凋亡,強度比bim α3弱(bim β5:28.17﹪;bim β6 28.13﹪).研究首次在細胞水平證明BH3核心序列可導致細胞凋亡,并提示bim蛋白BH3 domain N側序列可

5、能有一個加強bim導致細胞凋亡的多肽片段.bim的表達譜分析提示bim的異構體表達譜可能作為組織細胞分化和組織特性的標志.bim L的酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)bim主要與MIF等抗凋亡蛋白結合,沒有發(fā)現(xiàn)其與其他bcl 2蛋白結合的證據(jù).AD293與HEK293對bim具有完全不同的反應特性.差減分析發(fā)現(xiàn)AD293高表達parvin、actin等黏附蛋白及PMSA3等抗凋亡蛋白,提示改變細胞黏附特性可以改變細胞對bim介導的細胞凋亡的反應特性.