人類基因hUBC16和GPx7的克隆與功能研究.pdf

1、本實驗室大規(guī)模的cDNA克隆與測序工作積累了大量的全長基因庫。借助大量的生物信息學(xué)手段，我們試圖從這些庫中去篩選可能與重要的生理途徑及人類疾病密切相關(guān)的基因進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上我們篩選到了兩條感興趣的基因分別進(jìn)行研究，它們是hUBCl6和GPx7。 hUBCl6的cDNA全長2252bp，編碼一個162個氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白序列分析顯示hUBCl6具有一個重要的功能結(jié)構(gòu)域：泛素結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugatinge

2、nzyme，UBC)結(jié)構(gòu)域。且信息學(xué)分析推測hUBCl6與擬南芥(Arabidopsisthaliana)UBCl6高度同源，可能為人類泛素結(jié)合酶蛋白家族的新成員。泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugatingenzyme)又簡稱為E2，是泛素系統(tǒng)的主要部件之一，作為一個中間橋梁般的角色，它從泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme，或簡稱Е1)接受泛素，和泛素形成了高能硫脂鍵，再把泛素交給下游的部件：泛

3、素連接酶(ubiquitinligase，或簡稱E3)或直接底物，底物被泛素修飾后，將被降解，或生命活動受到調(diào)節(jié)。 經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)hUBCl6可能定位于細(xì)胞核中，用NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blastn,blastp等生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)hUBCl6的蛋白C端具有兩個核定位信號，在102位的半胱氨酸可能是它的酶活中心，并且用體內(nèi)體外實驗驗證了酶活中心的確是102位的Cys；亞細(xì)胞定位實驗表明hUBCl6主要定位于細(xì)胞核中與生物信息

4、學(xué)預(yù)測的結(jié)果一致，我們也用實驗證實了活性中心對于hUBCl6的正確定位發(fā)揮著與核定位信號同等重要的作用；酵母雙雜交實驗篩選出一些潛在的可能與hUBCl6相互作用的蛋白：ERALl：UBElv2；RNFl67；KIAAl972；RNF8。細(xì)胞周期實驗檢測發(fā)現(xiàn)，hUBCl6的上調(diào)表達(dá)會促使處于細(xì)胞周期S期的細(xì)胞比例增加，而下調(diào)hUBCl6的表達(dá)會導(dǎo)致處于細(xì)胞周期S期的細(xì)胞比例減少，表明hUBCl6對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，但其促進(jìn)細(xì)胞周期的分

5、子機(jī)理仍然還不清楚，有待進(jìn)一步實驗的深入研究。 谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs)可以保護(hù)細(xì)胞免受由呼吸代謝產(chǎn)生的活性氧自由基的氧化傷害，也具有與細(xì)胞周期、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控相關(guān)的功能，我們克隆到一個人cDNA序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其編碼一個長187個氨基酸的蛋白具有GSHPx的結(jié)構(gòu)域和BtuE的基序，并且通過基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)信息分析表明它就是NPGPx基因。通過生物信息學(xué)EST分析，以及組織表達(dá)譜分析，證實它在正常組織中廣譜

6、表達(dá)，具有腫瘤組織表達(dá)特異性。我們克隆了全長GPx7的cDNA，亞細(xì)胞定位預(yù)測與亞細(xì)胞定位實驗表明GPx7主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。酵母雙雜交實驗篩選出一些潛在的可能與GPx7相互作用的蛋白：RANandEIF3S12。序列分析發(fā)現(xiàn)RAN是原癌基因Ras超家族中的成員，對細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用，而EIF3S12目前僅知道它是真核轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子3的一個亞基，可能參與真核基因的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞周期實驗證明GPx7的上調(diào)表達(dá)會使細(xì)胞周期G1期細(xì)胞所占比例增加

7、，同時S期細(xì)胞所占比例急劇減少，此外同時上調(diào)GPx7與RAN的結(jié)果發(fā)現(xiàn)比單獨上調(diào)表達(dá)RAN而引起的S期細(xì)胞增加比例要小，上述結(jié)果看出GPx7可能對細(xì)胞周期進(jìn)程具有抑制作用。 綜合而言，我們克隆了一條新的人類泛素結(jié)合酶基因hUBCl6和一條已報道的谷胱甘肽過氧化物酶基因GPx7并對它們的功能進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示hUBCl6與GPx7都與細(xì)胞周期有關(guān)，hUBCl6可能對細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用，而GPx7的上調(diào)可能對細(xì)胞周期進(jìn)程起到抑制