人類鋅指蛋白新基因ZNF328的克隆與功能研究.pdf

1、　　轉(zhuǎn)錄因子在多種細(xì)胞功能中擔(dān)任了重要角色，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。人們已經(jīng)鑒定了幾個(gè)大的轉(zhuǎn)錄因子家族。在哺乳動(dòng)物中，含KRAB結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白(KRAB-ZFP)家族是人類基因中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，研究表明許多KRAB-ZFP基因與心臟發(fā)育以及心血管疾病都有關(guān)系。我們從人類胚胎心臟cDNA文庫(kù)中克隆鑒定了一個(gè)鋅指基因，經(jīng)國(guó)際基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)命名為ZNF328。該基因全長(zhǎng)4511bp，其開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)237

2、6bp，編碼了792個(gè)氨基酸，在N端含有一個(gè)KRAB框，C端含有15個(gè)C2H2型鋅指。ZNF328由8個(gè)外顯子組成，在基因組上跨越大約28kb，其中外顯子6、7分別編碼了KRAB框的A和B框；ZNF328位于染色體帶19q13.4上。Norternblot分析該蛋白在大部分的成體和胚胎組織中都有表達(dá)。亞細(xì)胞定位分析表明ZNF328蛋白定位在細(xì)胞核中。用Gal-4DNA結(jié)合系統(tǒng)對(duì)ZNF328進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，說(shuō)明該基因是個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，結(jié)構(gòu)域

3、分段分析表明KRAB框起主要的抑制作用。在COS-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ZNF328抑制了SRE和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，而這兩種因子是MAPK信號(hào)途徑介導(dǎo)的重要因子，說(shuō)明ZNF328蛋白可能在MAPK信號(hào)途徑中作為抑制因子介導(dǎo)細(xì)胞功能。為了觀察新基因過(guò)表達(dá)后細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，構(gòu)建了pCMV-Tag2B-ZNF328真核表達(dá)載體，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將ZNF328基因?qū)際eLa細(xì)胞系中，通過(guò)G418篩選，并經(jīng)PT-PCR鑒定，鑒定了穩(wěn)定表達(dá)的

4、細(xì)胞系。提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白，采用雙向凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，軟件分析統(tǒng)計(jì)ZNF328穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞二維圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)，并與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞蛋白質(zhì)點(diǎn)比較，結(jié)果表明該基因的穩(wěn)定表達(dá)可導(dǎo)致Hela細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變。綜合該基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征，本文初步得出結(jié)論認(rèn)為：ZNF328基因是參與多種人類胚胎器官發(fā)生的鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子?！　”疚倪€研究了另外一個(gè)人類鋅指蛋白家族新成員ZNF382的功能，將其開(kāi)放閱讀框克隆至pRSETC及pEG