基于批式發(fā)酵模型的益生元體外評(píng)價(jià)方法的優(yōu)化及應(yīng)用.pdf

1、傳統(tǒng)意義上，益生元是指可以被腸道中的有益菌選擇性發(fā)酵，并特異性地促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)和/或活性，進(jìn)而改善宿主健康的不消化物質(zhì)。特異性富集雙歧桿菌和乳桿菌的能力常作為益生元的判別標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)，益生元概念被重新修訂，是指一類可被腸道菌群代謝進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和/或活性，起到改善宿主生理健康的不消化物質(zhì)。益生元的評(píng)價(jià)往往通過(guò)體外模型、動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)三種方法結(jié)合來(lái)完成。體外批式發(fā)酵模型經(jīng)濟(jì)快速，廣泛用于從大量食物成分中初篩潛在益生元物質(zhì)，保

2、障后續(xù)高成本的動(dòng)物和臨床研究的有效性。
　　然而，同樣基于批式發(fā)酵模型，不同研究者對(duì)同一種益生元調(diào)節(jié)腸道菌群作用的報(bào)道往往不相一致。本論文通過(guò)分析產(chǎn)生這種不一致的因素，如發(fā)酵模型的營(yíng)養(yǎng)類型、評(píng)價(jià)參照系以及菌群分析方法，來(lái)建立優(yōu)化的益生元體外評(píng)價(jià)方法，以作為使該模型標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)。
　　首先采用寡營(yíng)養(yǎng)和富營(yíng)養(yǎng)兩種營(yíng)養(yǎng)類型的體外批式發(fā)模型，觀察接種了健康人腸道菌群后菌群結(jié)構(gòu)和活性的變化情況。兩種營(yíng)養(yǎng)類型分成5個(gè)處理，分別是寡營(yíng)養(yǎng)的

3、磷酸鹽緩沖液培養(yǎng)基（低蛋白質(zhì)低膽汁酸鹽）接種糞懸液至終濃度為5%（P5）、10%（P10）和16%（P16），和富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（高蛋白高膽汁酸鹽）接種糞懸液至1%（B1）和5%（B5），以培養(yǎng)0時(shí)刻為基線對(duì)照，以未加益生元組為陰性對(duì)照。采用變性梯度凝膠電泳和454焦磷酸測(cè)序技術(shù)監(jiān)測(cè)菌群，對(duì)代謝物進(jìn)行pH、短鏈脂肪酸和膽汁酸鹽測(cè)定。結(jié)果顯示：接種菌群在寡營(yíng)養(yǎng)的三種處理中變化較小，且變化特征一致；而在富營(yíng)養(yǎng)的兩種處理中變化較大，特征不同。從菌

4、群隨時(shí)間變化的特征來(lái)看，富營(yíng)養(yǎng)的B1模型中出現(xiàn)了高脂高蛋白飲食人群中普遍存在的菌群失調(diào)特征，即蛋白質(zhì)分解菌和膽汁酸鹽耐受菌豐度大幅增加，膽汁酸鹽敏感菌豐度大幅下降甚至被清除。本研究表明，寡營(yíng)養(yǎng)和富營(yíng)養(yǎng)模型中的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)接種菌群具有顯著的影響，因此，在應(yīng)用體外模型評(píng)價(jià)益生元作用時(shí)不僅需要基線對(duì)照，也必須納入陰性對(duì)照，以更好地揭示益生元對(duì)菌群的調(diào)節(jié)作用。
　　B1模型的菌群變化特征類似于高脂高蛋白飲食人群中普遍存在的菌群失調(diào)特征，而P

5、5模型能夠代表低蛋白質(zhì)低膽汁酸的腸道營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，因此，在后續(xù)分析中選擇了P5和B1體系分別作為寡營(yíng)養(yǎng)和富營(yíng)養(yǎng)模型的代表。
　　為了進(jìn)一步考察發(fā)酵模型和菌群分析方法對(duì)益生元評(píng)價(jià)結(jié)果的影響，我們?cè)赑5和B1模型中，對(duì)一種益生元配方對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了體外評(píng)價(jià)。基于焦磷酸測(cè)序的菌群分析結(jié)果顯示，益生元在兩種模型中均顯著調(diào)節(jié)了腸道菌群，但調(diào)節(jié)的作用存在明顯差異。在挑選出的50個(gè)被益生元調(diào)節(jié)的關(guān)鍵OTU中，僅8個(gè)在兩體系中的變化一致（7

6、個(gè)升高，1個(gè)降低）。P5中，益生元富集了Faecalibacterium和Prevotella等；B1中，益生元富集了
　　Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium和Lactobacillus等，抑制了Streptococcus、Escherichia/Shigella和Bilophila等。此外，益生元還調(diào)節(jié)了大量目前功能尚難以確定或研究尚不充分的腸道共生菌，例如Oscilliba

7、cter、Dialister和Alistipes屬的細(xì)菌等。此外，在相同處理之下，同一個(gè)菌屬內(nèi)的不同種（OTU）對(duì)益生元的響應(yīng)存在差異。因此，傳統(tǒng)基于靶向菌群分析手段所揭示的益生元調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，有待運(yùn)用高通量測(cè)序等非靶向菌群分析技術(shù)，并在物種水平重新分析和認(rèn)識(shí)。
　　綜上，考慮到P5和B1模型中益生元評(píng)價(jià)結(jié)果存在顯著差異，以及兩種模型在營(yíng)養(yǎng)特征上各自具有一定的代表性，我們提出了一套優(yōu)化的益生元體外評(píng)價(jià)方法：寡營(yíng)養(yǎng)和富營(yíng)養(yǎng)模型

8、同時(shí)使用，與陰性對(duì)照進(jìn)行比較，采用非靶向的二代測(cè)序菌群分析技術(shù)，并在種的水平揭示益生元對(duì)菌群的調(diào)節(jié)作用。
　　最后，運(yùn)用上述方法評(píng)價(jià)了低聚果糖和抗性糊精對(duì)人體腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，兩種益生元均可顯著調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制機(jī)會(huì)性致病菌的作用相似，富集有益菌的偏好不同。低聚果糖在寡營(yíng)養(yǎng)體系富集了丁酸鹽產(chǎn)生菌Faecalibacterium，在富營(yíng)養(yǎng)體系富集了Blautia、Lactobacillus、un_Lachnos

9、piraceae、
　　Faecalibacterium、Megamonas和Bifidobacterium?？剐院趦煞N營(yíng)養(yǎng)體系均主要富集了un_Lachnospiraceae。相應(yīng)地，兩種益生元抑制蛋白特異性發(fā)酵產(chǎn)物支鏈脂肪酸的效應(yīng)相似，累積有益短鏈脂肪酸的偏好不同。低聚果糖富集乙酸的作用強(qiáng)，富集高濃度丁酸的作用依賴于寡營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵環(huán)境；抗性糊精可穩(wěn)定地富集丙酸和丁酸?；贑aco-2細(xì)胞模型評(píng)價(jià)發(fā)酵代謝物的功能的結(jié)果顯示，低聚

10、果糖在寡營(yíng)養(yǎng)模型對(duì)菌群代謝物的調(diào)節(jié)具有促進(jìn)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其他情況均無(wú)明顯效應(yīng)。綜上，在調(diào)節(jié)菌群組成方面，低聚果糖的作用更優(yōu)；在對(duì)菌群代謝物影響腸上皮細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)方面，低聚果糖存在優(yōu)勢(shì)，但這種優(yōu)勢(shì)依賴于寡營(yíng)養(yǎng)的發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)環(huán)境；在累積丁酸的作用方面，抗性糊精在寡營(yíng)養(yǎng)和富營(yíng)養(yǎng)模型中均能累積高濃度丁酸。
　　本研究提出了優(yōu)化的益生元體外評(píng)價(jià)方法，并以此方法比較了兩種公認(rèn)的益生元物質(zhì)對(duì)人體腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的體外調(diào)節(jié)作用，論證了這一