CYP450酶活性評價的體外“cocktail”模型的優(yōu)化與應用.pdf

1、細胞色素P450(cytochrome P450，CYPs)是體內最大的藥物代謝酶蛋白超家族之一，由許多的同工酶組成。涉及藥物代謝的CYP450酶系主要是CYP1、CYP2、CYP3三個家族的幾種酶：如：CYP1A2、CYP2A6、CYP286、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4等，并且它們參與了90％以上的臨床藥物的代謝，對許多內源、外源性化合物在體內的Ⅰ相生物轉化起到重要作用。研究藥

2、物的相互作用的方法有體外方法(in vitro)、體內方法(in vivo)，計算機模擬方法(in silico)。在新藥研發(fā)早期的篩選研究中，利用人肝微粒體孵育技術評價藥物對探針代謝情況是體外研究藥物相互作用較為成熟的一個方法。經典的方法即是，通過孵育特異性的探針藥物，經過特定的亞型酶代謝，檢測代謝物的生成量從而反應酶活性的信息。近年來，隨著高靈敏高選擇的液質聯(lián)用(LC/MS/MS)技術的廣泛應用，以及組合化學的發(fā)展，同時給予多種探針

3、藥物，即“cocktail”法，來獲取多個代謝酶活性評價信息的方法也得到了迅速發(fā)展。 近年來，中藥的應用越來越廣泛，臨床上中藥與其它藥物合并用藥發(fā)生相互作用的幾率也增大。在這些由相互作用引起的不良反應中，中藥對細胞色素P450酶的影響占了很大的比例。大量研究已經應用各種方法證明多種中藥的活性成分是CYPs的底物、抑制劑或誘導劑。面對成千上萬種中藥單體，我們必須建立一種便捷、可靠的高通量篩選的方法，也就是上述的“cocklail”

4、方法，來研究它們對CYPs的影響從而預測可能存在的藥物相互作用。 本課題組已經成功建立了含有6種CYP(包含CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4)亞型的“cocktail”方法，并對多種黃酮類、帖類中藥單體進行了考察。近期研究表明，CYP286的表達占到了整個CYP450酶表達的6％，而且在許多非肝組織中也發(fā)現(xiàn)了CYP286的表達，比如腦部，肺部。CYP2A6主要在肝臟中表達，約占

5、總肝細胞色素P450的5％。CYP2A6除了參與一些臨床藥物，例如甲氧氟烷、氯甲噻唑、香豆素等的代謝外，還是某些致癌物(黃曲霉素B)及環(huán)境化合物(汽油醚)的代謝酶。CYP2C19也占了整個肝表達的2％。 本課題組已經成功建立了含有6種CYP亞型的“cocktail”方法，因此，本研究的目的就是在此基礎上進一步建立包含對CYP2A6、CYP286、CYP2C19評價的“cocktail”方法，并對姜黃素類似物及香豆素類中藥單體進行

6、篩選，以考察其對此3種亞型的抑制程度。研究共分為以下四個部分。 第一部分人肝微粒體中3種探針代謝物的LC/MS/MS分析方法的建立 目的： 建立檢測人肝微粒體中7-羥基香豆素、羥基丁氨苯丙酮、5-羥基奧美拉唑以及內標氯雷他定的LC/MS/MS方法。 方法： 人肝微粒體樣品以乙酸乙酯(0.5 mL)為萃取劑，以氯雷他定為內標。質譜條件為：離子源ESI+，選擇反應監(jiān)測模式(SRM)，監(jiān)測離子：m/z1

7、63→107(7-羥基香豆素)，m/z256→167(羥基丁胺苯丙酮)，m/z362→214(5-羥基奧美拉唑)。m/z383→262(內標)。液相條件：分離柱C18 XTerra MS分析柱(5μm，150×2.1 mm．Waters，USA)；流動相為甲醇：水(含0.1％甲酸)(80：20，v/v)，流速為250μL/min，柱溫為室溫。分析時間為3.5 min。 結果： 7.羥基香豆素/羥基丁氨苯丙酮/5-羥基奧美

8、拉唑的線性范圍分別為0.032/0.32/0.078/—2/20/5μM。三個質控濃度為：0.064/0.64/0.156μM，0.25/2.5/0.625μM和1/10/2.5μM。三者的萃取回收率分別為93.4-97.0％/75.6-87.9％/87.3-95.1％。三者的批內及批間精密度、準確度、穩(wěn)定性的RSD及偏離度均小于15％。三者的基質效應分別為101.6-112.8％/86.5-96.4％/97.3-103.9％，而且是非

9、濃度依賴型的，基質效應很小，不會影響檢測，符合生物樣本檢測的要求。 結論： 建立了檢測人肝微粒體中7-羥基香豆素、羥基丁氨苯丙酮、5-羥基奧美拉唑以及內標的濃度LC/MS/MS方法，方法精密度、準確度好，靈敏度高，適用于后續(xù)研究。 第二部分人肝微粒體體外“cocktail模型的建立與驗證 目的： 優(yōu)化人肝微粒體的體外孵育體系；比較探針在“individual”和“cocktail”模型中的各種代謝

10、行為，以驗證“cockiail”模型的準確可行。 方法： 1、優(yōu)化人肝微粒體的體外孵育體系。 2、求算各種特異性抑制劑在兩個模型中的IC50值，并進行比較來驗證“cocktail”模型的準確可行。 μ結果： 1、優(yōu)化后的人肝微粒體體外孵育體系為：總體積為0.2 mL，蛋白濃度為0.25mg/mL，反應時間為20 min。 2、香豆素、丁胺苯丙酮、奧美拉唑的特異性抑制劑甲氧沙林(CYP2A6

11、)，噻氯匹啶(CYP286)，氟康唑(CYP2C19)在“individual”和“cocktail”模型中IC50值分別為：6.39，11.30；0.2557，0.2122；6.52，15.22μM。兩者數(shù)值相近。 結論： 建立了優(yōu)化的人肝微粒體的體外孵育體系；特異性抑制劑在“individual”和“cocktail”模型中IC50值也相似，且與文獻報道相似。證明“cocktail”模型準確可行，為后續(xù)的中藥單體篩選

12、奠定了基礎。 第三部分應用體外“cocktail”模型評價姜黃素類似物對CYP酶的影響 目的： 應用此“cocktail”模型對6種姜黃素類似物進行篩選，評價它們對3種CYPs亞型的抑制程度。 方法： 不同濃度的姜黃素類似物和底物混合液共同孵育，與空白對照(只含等量的溶劑)相比較，通過“二步法”來評價其對CYPs各個亞型的抑制作用。第一步：首先將每個姜黃素類似物設定3個濃度(1，10，50μM)，

13、進行初步地篩選，判斷其對CYP酶的抑制程度。第二步：根據第一步的結果，對于那些抑制作用較強的姜黃素類似物，設定合理的濃度范圍(5或6個濃度點)，用Graphpad Prism來計算，進一步求算出確切的IC50值。 結果： 6種姜黃素類似物對CYP2A6、CYP2C19的IC50均大于50μM，無抑制影響；姜黃素類似物B及F對CYP286的IC50為分別為13.95μM及13.35μM，均是弱抑制劑。 結論：

14、 應用體外cocktail法成功地對6種姜黃素類似物進行了篩選。并篩選出兩種體外有一定抑制能力的化合物，提示有可能會引起藥物的相互作用。 第四部分應用體外“cocktail”模型對香豆素類中藥單體進行抑制篩選 目的： 應用體外“cocktail”模型對12種香豆素類中藥單體進行篩選，明確它們對CYPs各個亞型的抑制作用。 方法： 通過“二步法”及Graphpad Prism來評價香豆素類中藥單體

15、對CYPs各個亞型的抑制作用并計算相應的IC50值。 結果： 結果表明6-羥基—7-甲氧基香豆素、毛兩面針素是CYP286的中等程度抑制劑，IC50分別是31.5μM、3.542μM；異嗪皮啶、雙香豆素、4-甲基—6，7-二羥基香豆素、6-甲基香豆素、4-乙氧基香豆素對2C19抑制的IC50值分別是2.613μM．6.673μM、1.333μM、27.68μM．3.09μM。 結論： 香豆素類中藥單體對3