鼠羧肽酶原B和蛇毒金屬蛋白酶Alfimeprase兩種蛋白在畢赤酵母中表達研究.pdf

1、羧肽酶原B由胰腺細胞分泌，起初以含信號肽及前肽的前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase B)形式存在，在轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程中被信號肽酶切除掉信號肽而形成無活性的羧肽酶原B(procarboxypeptidase B，proCPB)，羧肽酶原B在小腸經(jīng)胰蛋白酶特異水解剪切前肽后而被活化成羧肽酶B。 羧肽酶B(carboxypeptidase B，CPB)是一類可水解蛋白或多肽底物C—端Lys或Arg的金屬蛋白

2、酶。羧肽酶B在科研上主要用于蛋白質(zhì)、多肽的測序；在醫(yī)學(xué)上用于診斷胰腺炎；另外，羧肽酶B是重組胰島素的生產(chǎn)過程中不可缺少的一個工具酶。目前，商業(yè)途徑獲得的羧肽酶B主要從豬胰臟中提取，使得產(chǎn)品價格昂貴，同時也不可避免地混雜有其它蛋白酶，如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶。除了從胰腺組織中直接提取外，羧肽酶B也可通過基因工程途徑獲得。Hartman等和Li等分別研究了鼠CPB在大腸桿菌中的原核表達。Eaton等和Ventura等曾在畢赤酵母(Pichi

3、a pastoris)中分別表達了人血漿羧肽酶原B和豬胰腺羧肽酶原B。王德解等利用巴斯德畢赤酵母pAOX1系統(tǒng)誘導(dǎo)表達了鼠羧肽酶原B，為探索利用GAP啟動子(pGAP)取代AOX1啟動子(pAOX1)的重組質(zhì)粒在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中組成型表達鼠羧肽酶原B的可能性，本實驗試圖利用巴斯德畢赤酵母pGAP系統(tǒng)組成型表達鼠羧肽酶原B。 本實驗中，根據(jù)GAP啟動子目的基因的序列設(shè)計上下游引物，應(yīng)用PCR技術(shù)

4、以質(zhì)粒pIB2為模板擴增了GAP啟動子基因片段，在目的基因的兩端分別引入SacⅠ和BamHⅠ兩個酶切位點，將GAP啟動子基因片段取代誘導(dǎo)型質(zhì)粒pPIC9K—proCPB上的AOX1啟動子基因片段構(gòu)建組成型表達質(zhì)粒pGAPK—proCPB。用BglⅡ線性化pGAPK—proCPB重組質(zhì)粒后，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，涂布MD平板，篩選出陽性菌落，在含0.2％的葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)工程菌，首次實現(xiàn)了鼠羧肽酶原B在畢赤酵