刺參絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的克隆、表達及性質(zhì)分析.pdf

1、刺參作為滋補食品和藥膳飲食，深受人們的喜愛。然而，刺參在捕撈、運輸和加工過程中極易發(fā)生自溶，給相關(guān)行業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。前期研究表明，刺參內(nèi)源性蛋白酶參與其自溶過程。目前為止，國內(nèi)外對于刺參自溶酶的基因信息及結(jié)構(gòu)特征研究甚少?；跒閲鴥?nèi)外學者在該領(lǐng)域的探索提供理論基礎(chǔ)，本論文以刺參為研究對象，首次從刺參內(nèi)臟中克隆得到絲氨酸蛋白酶(serine proteinase，SP)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrixmetalloproteinas

2、e-2，MMP-2)的基因序列，并利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)SP和MMP-2的體外表達，獲得有活性的重組蛋白酶，同時對其進行性質(zhì)分析。
　　根據(jù)已獲得的刺參內(nèi)臟SP部分氨基酸序列設(shè)計特異性引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得其基因全長共1367 bp，包括44bp5'端非編碼區(qū)和192 bp3'端非編碼區(qū)。其ORF為1131bp，編碼377個氨基酸殘基，其中Asp138、His176和Ser325構(gòu)成SP的催化三聯(lián)體。刺參SP屬于S

3、ubtilisin家族絲氨酸蛋白酶，其三級結(jié)構(gòu)中含有6個平行的β折疊片，被兩側(cè)的α螺旋包圍，形成典型的“三明治”結(jié)構(gòu)，此外，在SP的C端還有2個β折疊型結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)的正確折疊等過程。進一步利用大腸桿菌表達系統(tǒng)體外表達重組刺參SP，通過HisTrap親和柱層析得到大量高度純化的重組刺參SP。利用重組刺參SP制備特異性多克隆抗體，進一步將具有良好效價和特異性的兔抗重組刺參SP特異性多克隆抗體與CNBr-activated Sepharo

4、se4B親和柱偶聯(lián)，制備親和層析柱純化得到一部分純度較高的天然SP。同時通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-SP并轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，利用甲醇誘導(dǎo)表達，獲得分子量為70kDa的有活性的重組刺參SP。
　　根據(jù)MMPs保守序列設(shè)計引物，首次擴增得到刺參MMP-2酶原的基因序列。刺參MMP-2酶原包括前肽結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域以及類血紅素結(jié)構(gòu)域。催化結(jié)構(gòu)域中包含3個相同的Ⅱ型纖連蛋白，其和類血紅素結(jié)構(gòu)域在空間上都是較獨立完整的，類血紅素結(jié)構(gòu)域通過鉸

5、鏈區(qū)與催化結(jié)構(gòu)域相連接。利用大腸桿菌表達刺參MMP-2催化結(jié)構(gòu)域，并通過HisTrap親和柱層析純化得到分子量約為40kDa的目的蛋白。通過稀釋復(fù)性，重組蛋白能夠進行正確折疊，首次獲得了大量有活性的重組刺參MMP-2。進一步利用明膠酶譜法對重組刺參MMP-2進行性質(zhì)研究，結(jié)果顯示重組刺參MMP-2在35℃～40℃活性最高，在pH7.5～9.0條件下都具有一定的酶活性，最適pH為8.0。此外，適量的金屬離子Ca2+可以顯著激活重組刺參MM