眼鏡蛇毒金屬蛋白酶激活和損傷內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究眼鏡蛇毒P-Ⅲ型金屬蛋白酶Atrase B通過(guò)補(bǔ)體致內(nèi)皮細(xì)胞活化和損傷的作用機(jī)制。
　　 方法:首先對(duì)補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)物致內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)通路的活化及抑制劑干預(yù)情況進(jìn)行研究，為研究眼鏡蛇毒金屬蛋白酶Atrase B經(jīng)補(bǔ)體作用內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制提供參照和背景。采用兩種眼鏡蛇毒蛋白（CVF、Atrase B）分別與正常人血清孵育。將血清孵育物作用于人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)，用ELISA方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中的黏附分子、炎癥因

2、子、趨化因子等的表達(dá)情況以及細(xì)胞內(nèi)NF-κB、p38MAPK及JAK2通路的活化情況。分別采用上述3個(gè)信號(hào)通路抑制劑PDTC、SB203580和AG490對(duì)其活化及黏附分子ICAM-1、MCP-1的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)研究。用western blot法檢測(cè)AtraseB與血清或補(bǔ)體成分孵育后細(xì)胞內(nèi)NF-κB和JAK2通路的磷酸化情況。
　　 結(jié)果: CVF使血清補(bǔ)體旁路途徑活化后可導(dǎo)致HMEC釋放的P-selectin和ICAM-1明顯

3、增加。細(xì)胞內(nèi)JAK2、p38MAPK、NF-κB通路明顯活化，分別在刺激2、15、30min后，分別檢測(cè)到3個(gè)通路的活化高峰;PDTC、SB203580、AG490可分別抑制NF-κB、p38MAPK、JAK2通路的活化。AG490對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化后的ICAM-1蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用，PDTC、SB203580對(duì)ICAM-1表達(dá)沒(méi)有明顯影響。眼鏡蛇毒P-Ⅲ型金屬蛋白酶Atrase B與血清孵育后，可致HMEC瞬時(shí)釋放P-selecti

4、n和vWF，進(jìn)而使E-selectin、ICAM-1的表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞內(nèi)JAK2和NF-κB通路明顯活化，且分別在2、30min檢測(cè)到其活化高峰。Atrase B與血清孵育后未檢測(cè)到p38MAPK通路的活化。PDTC和AG490對(duì)MCP-1的表達(dá)都有抑制作用。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:AtraseB與血清孵育后，NF-κB和JAK2通路發(fā)生了磷酸化。Atrase B與補(bǔ)體成分C6孵育后，也檢測(cè)到NF-κB的磷酸化。
　　

5、 結(jié)論:Atrase B與血清孵育后可使內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥因子、黏附分子的表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制可能是Atrase B酶切補(bǔ)體產(chǎn)生活性片段，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)通路的激活。Atrase B與血清補(bǔ)體孵育對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的活化與CVF激活補(bǔ)體旁路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用既有相似性，也有不同。Atrase B作用血清補(bǔ)體后，可使細(xì)胞內(nèi)NF-κB和JAK2通路明顯活化，而未檢測(cè)到p38MAPK通路的活化。其中對(duì)JAK2通路有效抑制可使MCP-1和ICAM-1的表