孕哺期不同程度碘缺乏對(duì)仔鼠小腦Pinceau結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響.pdf

1、目的：
　　碘對(duì)甲狀腺激素(thyroid hormone，TH)的合成起到了至關(guān)重要的作用。TH又影響著中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。由于碘缺乏而引起的甲狀腺激素合成障礙會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育紊亂，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙。在妊娠過(guò)程中，母體是T4和碘供應(yīng)的唯一來(lái)源。故母體的TH供應(yīng)是影響著子代正常生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因素所在。母體碘供應(yīng)不足致使TH缺乏可直接導(dǎo)致子代腦發(fā)育期TH供應(yīng)不足，損傷腦發(fā)育，造成子代不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，出現(xiàn)聽(tīng)力、

2、言語(yǔ)、行為、認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)方面的障礙。自我國(guó)實(shí)施了全民食鹽加碘計(jì)劃后，重度碘缺乏得到了控制，但仍會(huì)出現(xiàn)輕度碘缺乏和邊緣性碘缺乏的情況。輕度碘缺乏會(huì)引起低甲狀腺素血癥，表現(xiàn)為血漿中游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)減少，而游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)和促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)含量沒(méi)有改變。邊緣性碘缺乏是更為輕微的一種碘缺乏，平

3、均尿碘中位數(shù)(medianurinary iodine，MUI)在100～150μg/L，表現(xiàn)為血漿中FT3和FT4含量沒(méi)有改變，但TSH可能出現(xiàn)輕微改變，T4總量下降。小腦的主要功能是運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)，浦肯野細(xì)胞是小腦的主要細(xì)胞和唯一的傳出神經(jīng)元，浦肯野細(xì)胞功能的適當(dāng)發(fā)揮依賴于pinceau結(jié)構(gòu)的發(fā)育成熟。本研究通過(guò)建立妊娠期和哺乳期輕度和邊緣性碘缺乏模型，研究不同程度碘缺乏是否影響pinceau結(jié)構(gòu)的發(fā)育成熟，并闡明是否通過(guò)干擾小腦pinc

4、eau結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白Ankyrin G(AnKG)、Neurofascin186(NF186)、NrCAM、β4-spectrin的作用機(jī)制。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
　　健康雌性Wistar大鼠(130-150 g)，按體重隨機(jī)分成4組:對(duì)照組、邊緣性碘缺乏組、輕度碘缺乏組和重度碘缺乏組。各組給予碘缺乏地區(qū)飼料，飲用水加入不同劑量的KI去離子水。保證四組雌鼠每日總攝碘量依次為:7.0μg/d、5.0μg/d

5、、3.0μg/d和1.5μg/d。雌性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3個(gè)月后，交配妊娠。以次晨發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物鏡檢發(fā)現(xiàn)精子者確定為妊娠0天(gestational day，GD0)。從GD0開(kāi)始到仔鼠出生后21天(postnatal day，PN21)，各組取孕鼠20-21只。每組飲食同前。
　　二、仔鼠血清FT4、FT3、TSH測(cè)定
　　仔鼠PN7、PN14、PN21，進(jìn)行心臟采血。血清離心，5000rpm離心10min。使用固相化學(xué)

6、免疫發(fā)光法測(cè)血清中FT3、FT4、TSH的含量。
　　三、碘缺乏飼料
　　碘缺乏飼料來(lái)自碘缺乏流行病區(qū)。根據(jù)AIN-93G的嚙齒動(dòng)物的飲食指南，在每公斤碘缺乏飼料中加入35 g礦物質(zhì)混合物(不含KI)、13 g賴氨酸、10 g維生素混合物、6.7g蘇氨酸、1 g膽堿、2.1g色氨酸、4.6g蛋氨酸。此外，為保證動(dòng)物攝入足夠的必需脂肪酸，每公斤飼料中加入10ml玉米油。食用這種補(bǔ)足了各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的碘缺乏飼料后再加入KI（7.0

7、μg/d），則基本上能保證母鼠和仔鼠的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。
　　四、小腦浦肯野細(xì)胞Pinceau結(jié)構(gòu)發(fā)育的形態(tài)學(xué)研究
　　分別于PN14和PN21時(shí)每組取6只仔鼠，4％多聚甲醛灌流固定小腦，用石蠟包埋后進(jìn)行小腦切片。在PN14和PN21時(shí)，小腦浦肯野細(xì)胞層Calbindin和GAD65，Calbindin和NF186免疫熒光組織化學(xué)染色，觀察仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞Pinceau結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)改變。用圖像分析系統(tǒng)及圖像分析軟件分析小腦各蛋

8、白表達(dá)的熒光平均強(qiáng)度。
　　五、小腦浦肯野細(xì)胞Pinceau結(jié)構(gòu)發(fā)育的相關(guān)蛋白western blot測(cè)定分析
　　分別于PN7、PN14和PN21時(shí)，每組選取6只仔鼠，斷頭后，進(jìn)行小腦剝離。采用westem blot方法分別測(cè)定小腦AnKG、NF186、NrCAM和β4-spectrin的蛋白水平。采用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)照相，檢測(cè)4種蛋白條帶的凈光密度值。
　　六、統(tǒng)計(jì)分析
　　結(jié)果表示為mean±SD。用

9、統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(ANOVA)比較仔鼠激素水平、免疫熒光染色的平均光密度和相關(guān)蛋白western blot結(jié)果。當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用SNK法進(jìn)行組間的比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、仔鼠激素水平變化
　　仔鼠PN7、PN14、PN21時(shí)，輕度碘缺乏組的血清FT4水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);輕度碘缺乏組血清FT3和TSH較對(duì)照組無(wú)

10、顯著變化(P＞0.05)，而重度碘缺乏組TH顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而且TSH顯著高于對(duì)照組P＜0.05）;邊緣性碘缺乏組TH水平較對(duì)照組稍微下降，但是與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且TSH水平無(wú)變化。但是較對(duì)照組相比，總T4在PN7、PN14和PN21各下降16.41％、18.16％和22.54％。
　　二、不同程度的碘缺乏減少小腦浦肯野細(xì)胞Pinceau抑制性突觸形成
　　在PN14和PN21時(shí)，鏡下可見(jiàn)，在對(duì)

11、照組中，由GAD65和Calbindin標(biāo)記的pinceau突觸在小腦浦肯野細(xì)胞層呈陽(yáng)性表達(dá)，緊密分布。與對(duì)照組相比，邊緣性碘缺乏組、輕度碘缺乏組和重度碘缺乏組GAD65陽(yáng)性表達(dá)顯著降低(P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;輕度碘缺乏組和重度碘缺乏組GAD65陽(yáng)性表達(dá)顯著低于邊緣性碘缺乏組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　三、不同程度碘缺乏抑制小腦浦肯野細(xì)胞Pinceau結(jié)構(gòu)形成及發(fā)育成熟
　　在PN14和PN21，鏡

12、下可見(jiàn)，在對(duì)照組中，由NF186和Calbindin標(biāo)記的pinceau結(jié)構(gòu)在小腦浦肯野細(xì)胞胞體和AIS表達(dá)，呈陽(yáng)性分布。與對(duì)照組相比，邊緣性碘缺乏組NF186陽(yáng)性表達(dá)顯著降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而輕度碘缺乏組和重度碘缺乏組NF186陽(yáng)性表達(dá)顯著低于對(duì)照組和邊緣碘缺乏組(P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　四、不同程度碘缺乏降低仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞Pinceau結(jié)構(gòu)發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)水平
　　在PN7，各組

13、仔鼠小腦AnKG蛋白表達(dá)均無(wú)明顯差異;在PN14和PN21，輕度碘缺乏組和重度碘缺乏組仔鼠小腦AnKG蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在PN14時(shí)，邊緣性碘缺乏組仔鼠小腦AnKG蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在PN7、PN14和PN21，輕度碘缺乏組和重度碘缺乏組仔鼠小腦β4-spectrin蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在PN14時(shí)，邊緣性碘缺乏組

14、仔鼠小腦β4-spectrin蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在PN21，重度碘缺乏組β4-spectrin蛋白表達(dá)較邊緣性碘缺乏組相比顯著降低(P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在PN7、PN14和PN21，與對(duì)照組相比，邊緣性碘缺乏組、輕度碘缺乏組和重度碘缺乏組仔鼠小腦NF186和NrCAM蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05），均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、孕期和哺乳期輕度及重度碘缺乏抑