碘缺乏致大鼠仔鼠小腦神經發(fā)育障礙及對相關蛋白Doublecortin、Reelin、Caveolin-1、Synaptotagmin-1表達的影響.pdf

1、目的:
　　 碘(Iodine，Ⅰ)是一種人體必需的重要的微量元素，在體內主要通過合成甲狀腺激素(Thyroid Hormone，TH)，并影響后者的合成與分泌活動進而發(fā)揮其生理功能。甲狀腺功能的正常發(fā)揮直接受膳食中碘含量的調節(jié)。甲狀腺激素是機體正常生長發(fā)育所必需的激素，具有促進組織分化、生長與發(fā)育成熟的作用，對中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育尤為重要。自然環(huán)境中缺碘可造成碘缺乏病。碘缺乏是導致人類神經系統(tǒng)發(fā)育損傷的重要原因之一。目前我國孕期

2、碘供應不足的狀況令人堪憂，母體碘的缺乏可直接導致子代發(fā)育期甲狀腺激素供應不足，致使子代生長發(fā)育障礙，尤其是中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育障礙。碘缺乏對新生兒生長發(fā)育有廣泛及嚴重的危害性，已成為嚴重影響人口社會發(fā)展的重大公共衛(wèi)生問題。小腦是甲狀腺激素發(fā)揮作用的重要靶器官，是研究碘缺乏致腦發(fā)育損傷的良好模型。碘缺乏致甲狀腺功能減退可致機體發(fā)生精神運動障礙，相應的臨床表現與小腦在生長發(fā)育過程中的一系列改變直接相關。碘缺乏可損傷神經系統(tǒng)正常的發(fā)育過程，甚至

3、造成不可逆的損傷，其分子機制尚不明確。Doublecortin，Reelin，Caveolin-1及Synaptotagmin-Ⅰ在神經系統(tǒng)生長發(fā)育過程中都可發(fā)揮重要作用。Doublecortin是新生神經元的標志分子，通過調節(jié)新生神經元微管的細胞骨架結構及其穩(wěn)定性，起到促進未成熟神經元遷移和分化的作用；Reelin表達可受甲狀腺激素直接調控，參與調節(jié)神經元細胞定向遷移，并幫助其完成正常的分化和定位。Caveolin-1廣泛分布于中樞神

4、經系統(tǒng)各類神經元細胞中，在細胞遷移中調劑細胞膜的成分和細胞表面的擴張，參與信號分子的極化和細胞骨架的重構；Synaptotagmin-Ⅰ參與突觸囊泡的胞吞與胞吐，在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中參與軸突外向生長過程。碘缺乏致甲狀腺功能減退影響大鼠仔鼠小腦發(fā)育過程中是否涉及到Doublecortin，Reelin，Caveolin-1及Synaptotagmin-Ⅰ的改變，這幾種蛋白的改變規(guī)律如何，目前尚不清楚。因此，我們采用碘缺乏飼料和不同劑量的丙

5、基硫尿嘧啶(PTU)飲水建立碘缺乏和甲狀腺功能減退動物模型，檢測仔鼠小腦細胞凋亡水平，應用免疫組織化學與Western blotting技術檢測不同發(fā)育階段仔鼠小腦組織中發(fā)育相關蛋白表達的變化規(guī)律，探討碘缺乏致神經系統(tǒng)發(fā)育損傷的相關分子機制。
　　 實驗方法:
　　 1、實驗動物與分組
　　 健康2月齡雌性Wistar大鼠，體重250g-280g。取孕鼠28只，按體重均衡原則隨機分為4組，每組7只孕鼠，分組及飲食

6、：碘缺乏組，缺碘飼料+去離子水；5ppm PTU組，普通飼料+5ppm PTU+去離子水；15ppm PTU組，普通飼料+15ppm PTU+去離子水；對照組，普通飼料+去離子水。自妊娠第6天(GD6)起，按照上述方式喂養(yǎng)，直至仔鼠出生后第28天(PND28);此后至PND42，各組均飼以普通飼料，飲用自來水。PND4時，每窩按雌雄數量盡可能相等的原則保留9-10只仔鼠。PND25時斷乳、分籠飼養(yǎng)。PND14、PND21、PND28和P

7、ND42時，每組隨機從不同窩中各抽取8只仔鼠，其中5只仔鼠灌流固定大腦，用于腦組織病理切片和形態(tài)學觀察；另3只仔鼠剝離小腦組織，用于WesternBlotting測定。
　　 2、仔鼠生長發(fā)育狀況觀察
　　 自PND0起，觀察仔鼠生長發(fā)育狀況，分別于PND14、PND21、PND28和PND42時稱取仔鼠體重。在整個實驗過程中記錄仔鼠行為、體重等常規(guī)指標。
　　 3、血清FT3、FT4測定
　　 在PND

8、14、PND21、PND28和PND42，每組分別隨機選取8只仔鼠，開胸采血，3000rpm離心5min，取上清。采用固相化學免疫發(fā)光法測定血清中游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)的含量。
　　 4、病理切片制備
　　 各組于PND14、PND21、PND28和PND42分別取5只仔鼠，采血后，剝離并固定小腦，常規(guī)石蠟包埋，行冠狀位連續(xù)切片（6μm），當看到切片包含完整的小腦組織時，每隔5、6

9、張連續(xù)切片收集1張，制成石蠟切片。
　　 5、原位末端標記熒光染色（TUNEL染色）
　　 每只仔鼠隨機選取3張切片，行TUNEL染色，熒光顯微鏡下觀察小腦皮質神經元細胞凋亡情況，隨機選取5個相同視野，每個視野下計數200個神經元細胞，計數陽性染色細胞數，取其平均值。
　　 6、免疫組織化學染色檢測Reelin蛋白免疫陽性表達
　　 分別于PND14、PND21和PND28每組取3只仔鼠標本，切片。免疫組

10、織化學染色，觀察小腦Reelin蛋白的免疫陽性表達。用圖象分析系統(tǒng)及圖象分析軟件分析小腦Reelin蛋白表達的積分光密度值。
　　 7、Western Blotting檢測小腦Doublecortin，Caveolin-1及Synaptotagmin-Ⅰ的表達
　　 每組分別從不同窩中隨機選取3只仔鼠，取大腦組織，剝離小腦。采用Western Blotting的方法分別檢測Doublecortin，Caveolin-1及

11、Synaptotagmin-Ⅰ的表達水平。
　　 8、統(tǒng)計學處理
　　 采用SPSS11.5建立數據庫，進行統(tǒng)計分析。結果表示為Mean±SD。數據分析比較均采用單因素方差分析(ANOVA)。滿足方差齊性時，兩兩比較采用最小顯著差值法（Least-significant Difference，LSD）；不滿足方差齊性時，兩兩比較采用Dunnett's T3法。P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:

12、　　 1、仔鼠生長發(fā)育狀況對照組子代大鼠體重增加較快，活動性強，對外界刺激反應較為敏感，體毛生長正常；碘缺乏組及PTU處理組（5ppm和15ppm）子代大鼠體重增加慢，體形較小，行動遲緩，反應遲鈍，被毛萌出晚且稀疏。對照組仔鼠的體重均顯著高于碘缺乏組、5ppm PTU處理組和15ppm PTU處理組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、大鼠仔鼠激素含量的變化在PND14-PND28期間，碘缺乏組、5ppm PTU處理

13、組和15ppm PTU處理組仔鼠的甲狀腺激素含量較對照組明顯下降，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而TSH含量較對照組則反饋性升高。PND42，停止碘缺乏飼料及PTU飲水后，激素水平逐漸恢復(P＞0.05)。
　　 3、碘缺乏與甲狀腺功能減退對大鼠仔鼠小腦神經細胞凋亡的影響PND14、PND21時，對照組仔鼠小腦神經細胞凋亡水平略低；與對照組相比，5ppmPTU處理組、碘缺乏組和15ppm PTU處理組凋亡水平依次升高，較對照

14、組有明顯差異，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 PND28，對照組鏡下未檢測出凋亡陽性細胞。碘缺乏組、5ppm PTU處理組和15ppm PTU處理組神經元細胞凋亡水平仍然處于較高水平(P＜0.05)。
　　 4、碘缺乏與甲狀腺功能減退對大鼠仔鼠腦生長發(fā)育相關蛋白的影響PND14和PND21，免疫組織化學染色結果顯示對照組reelin陽性表達高于實驗組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。PND28，各組表達水平相

15、近，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Western blotting結果顯示，在PND14，Dcx蛋白表達實驗組與對照組相比顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；在PND21和PND28，Dcx表達實驗組與對照組相比顯著升高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。PND28和PND42，Caveolin-1表達實驗組與對照組相比顯著升高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Synaptotagmin-Ⅰ表達實驗組與對照組相比顯著降低，