碘缺乏致甲狀腺功能減退損傷仔鼠海馬DG區(qū)樹突發(fā)育及其相關(guān)機制研究.pdf

1、目的
　　 碘是合成甲狀腺激素的主要原料，對甲狀腺功能正常發(fā)揮起重要作用。碘攝入不足引起的碘缺乏病是一種世界性的地方病。碘缺乏是引起原發(fā)性甲狀腺功能減退癥的常見原因。孕期和哺乳期碘缺乏致甲狀腺功能減退引起子代不可逆性腦損傷并導(dǎo)致智力障礙。雖然目前碘缺乏病是可預(yù)防的，且已采取措施進(jìn)行干預(yù)，但碘缺乏仍是全球性公共衛(wèi)生問題之一，孕期和哺乳期婦女碘缺乏現(xiàn)象仍普遍存在，其子代也將暴露于甲狀腺功能減退狀態(tài)，而處于腦發(fā)育期的嬰幼兒對于該狀態(tài)更

2、為敏感。我們以前工作發(fā)現(xiàn)，孕期和哺乳期碘缺乏與大鼠子代海馬存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)減少，神經(jīng)纖維受損。即使成年后甲狀腺激素水平恢復(fù)正常，但受損神經(jīng)元仍然存在。雖然發(fā)育期甲狀腺功能減退損傷海馬可塑性已得到廣泛證實，但孕期和哺乳期碘缺乏如何影響出生后海馬新生神經(jīng)元仍不清楚。為構(gòu)建神經(jīng)環(huán)路，新生神經(jīng)元需通過樹突與軸突進(jìn)行相互問信息傳遞?？梢姌渫辉谏窠?jīng)發(fā)生中的重要地位，然而孕期和哺乳期碘缺乏調(diào)節(jié)海馬樹突發(fā)育的機制還未明確。胞內(nèi)蛋白β-catenin在神經(jīng)

3、元樹突生長發(fā)育中起重要作用。細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase5，Cdk5)活性異常不利于細(xì)胞生存。β-catenin可與Cdk5的亞基p35結(jié)合，Cdk5激酶活性的降低能使更大的聚集體出現(xiàn)；反之引起游離的β-catenin表達(dá)增多。孕期和哺乳期碘缺乏致甲狀腺功能減退對仔鼠出生后海馬新生神經(jīng)元樹突發(fā)育有何影響？據(jù)此，我們采用碘缺乏飼料和丙基硫尿嘧啶(Propylthiouracil，PTU)飲水建立

4、碘缺乏致甲狀腺功能減退動物模型，觀察碘缺乏致甲狀腺功能減退對海馬新生神經(jīng)元樹突發(fā)育的影響，分析β-catenin和N-cadherin在新生神經(jīng)元胞漿中表達(dá)的變化及β-catenin、N-cadherin和p35、Cdk5總體表達(dá)的變化規(guī)律，探討碘缺乏致甲狀腺功能減退引起海馬新生神經(jīng)元樹突發(fā)育障礙的相關(guān)機制。
　　 實驗方法：
　　 1、實驗動物與分組
　　 用健康雌性Wistar大鼠(250 g～280 g)，

5、選取21只成功受孕大鼠，按體重均衡原則隨機分為3組，每組7只孕鼠，分組及飲食為：碘缺乏組，缺碘飼料+自來水；PTU組，普通飼料+5 ppm PTU+自來水；對照組，普通飼料+自來水。自妊娠第6天起，按照上述方式喂養(yǎng)，直至仔鼠出生后第28天(PND28)。于PND4，每窩按雌雄數(shù)量盡可能相等的原則保留9-10只仔鼠。于PND21斷乳、分籠飼養(yǎng)。于PND14、21和28，每組隨機從不同窩中各抽取8只仔鼠，其中5只仔鼠用于海馬組織免疫熒光染色

6、觀察；另3只仔鼠剝離海馬組織用于蛋白測定。
　　 2、仔鼠血清甲狀腺激素和促甲狀腺激素測定
　　 分別于PND14、21和28時，每組分別隨機選取8只仔鼠，開胸采血，取上清，-70℃保存。采用固相化學(xué)免疫發(fā)光法測定血清中游離甲狀腺素、游離三碘甲狀腺原氨酸和促甲狀腺激素的含量。
　　 3、海馬新生神經(jīng)元樹突發(fā)育觀察
　　 各組于PND14、21和28分別取5只大鼠，采血后，固定大腦，常規(guī)石蠟包埋，行冠狀位連

7、續(xù)切片(6μm)，當(dāng)觀察到切片包含完整的海馬時，每隔5～6張連續(xù)切片收集1張，制成石蠟切片。每只仔鼠隨機選取3張切片，免疫熒光標(biāo)記新生神經(jīng)元，鏡下觀察DG區(qū)和CA1區(qū)新生神經(jīng)元樹突分支導(dǎo)向及長度變化。
　　 4、海馬相關(guān)蛋白檢測分析
　　 各組于PND14、21和28分別取3只大鼠，取大腦組織，剝離海馬，按其組織學(xué)結(jié)構(gòu)切分為DG區(qū)和CA1區(qū)。采用Western Blotting技術(shù)分別檢測DG區(qū)和CA1區(qū)β-cateni

8、n、N-cadherin和p35、Cdk5的表達(dá)。
　　 5、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 采用SPSS建立數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。β-catenin、N-cadherin和p35、Cdk5表達(dá)的比較均采用單因素方差分析。滿足方差齊性時，兩兩比較采用最小顯著差值法；不滿足方差齊性時，兩兩比較采用Dunnett's T3法。P<0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義，方差齊性檢驗水準(zhǔn)定為0.1。
　　

9、 結(jié)果：
　　 1、碘缺乏致甲狀腺功能減退對仔鼠激素含量的影響
　　 在PND14至28期間，碘缺乏組和PTU處理組仔鼠的甲狀腺激素含量較對照組明顯下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而促甲狀腺激素含量則反饋性較對照組升高，提示甲狀腺功能減退。
　　 2、碘缺乏致甲狀腺功能減退對仔鼠海馬新生神經(jīng)元樹突發(fā)育的影響
　　 于PND14、21和28，用Dcx標(biāo)記新生神經(jīng)元的遷移過程，早期表現(xiàn)為樹突分支缺乏

10、且長度較短，后期表現(xiàn)為樹突分支復(fù)雜且較長。碘缺乏組和PTU處理組仔鼠海馬DG區(qū)樹突發(fā)育明顯滯后于對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光雙標(biāo)染色觀察發(fā)現(xiàn)β-catenin主要定位于新生神經(jīng)元樹突分支與胞質(zhì)中，而細(xì)胞核中少見。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，碘缺乏組和PTU處理組仔鼠海馬DG區(qū)新生神經(jīng)元表達(dá)β-catenin的陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。另外N-cadherin在新生神經(jīng)元定位與β-catenin近似

11、。在海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層中，各組均發(fā)現(xiàn)Dcx標(biāo)記新生神經(jīng)元，雖然碘缺乏組和PTU處理組仔鼠新生神經(jīng)元數(shù)量與對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但碘缺乏組和PTU處理組仔鼠新生神經(jīng)元在形態(tài)上表現(xiàn)出胞體變小，樹突分支扭曲。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，碘缺乏組和PTU處理組仔鼠海馬CA1區(qū)新生神經(jīng)元表達(dá)β-catenin的陽性細(xì)胞數(shù)與對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4、碘缺乏致甲狀腺功能減退對仔鼠海馬β-cateni

12、n、N-cadherin和p35、Cdk5表達(dá)的影響
　　 Western Blotting結(jié)果顯示，DG區(qū)，碘缺乏組和PTU處理組于PND21和28，β-catenin和N-cadherin表達(dá)高于對照組，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；于PND14、21和28，碘缺乏組和PTU處理組p35表達(dá)較對照組明顯減少，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在Cdk5表達(dá)上，碘缺乏組和PTU處理組與對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0

13、.05)。CA1區(qū)，碘缺乏組和PTU處理組于PND21和28，β-catenin和N-cadherin表達(dá)較對照組增多，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，于PND14，碘缺乏組和PTU處理組與對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；于PND14、21和28，碘缺乏組和PTU處理組p35表達(dá)較對照組明顯減少，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在Cdk5表達(dá)上，碘缺乏組和PTU處理組與對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。<

14、br>　　 結(jié)論：
　　 1、碘缺乏致甲狀腺功能減退延緩出生后21、28天仔鼠海馬DG區(qū)顆粒層新生神經(jīng)元樹突發(fā)育。
　　 2、碘缺乏致甲狀腺功能減退造成出生后21、28天仔鼠海馬DG區(qū)顆粒層新生神經(jīng)元胞漿中表達(dá)β-catenin的陽性細(xì)胞數(shù)減少，從而延緩DG區(qū)顆粒層新生神經(jīng)元樹突發(fā)育。
　　 3、碘缺乏致甲狀腺功能減退對仔鼠海馬DG區(qū)β-catenin和N-cadherin蛋白表達(dá)無明顯影響，引起p35表達(dá)減少