GRK4變異體A142V對ETBR的調控在原發(fā)性高血壓發(fā)生中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　目前，高血壓發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，并已成為冠心病，腦卒中，心肌梗死，心衰及腎功衰等疾病的重要危險因素之一。高血壓發(fā)病機制復雜，包括多種因素，如中樞神經系統(tǒng)、血管系統(tǒng)、腎臟及心臟等，其中腎臟介導水鈉排泄功能障礙是高血壓發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。機體水鈉調節(jié)主要受多巴胺、血管緊張素、抗利尿激素、內皮素、醛固酮等眾多神經體液因子的影響。近年來，內皮素系統(tǒng)在水鈉平衡中的作用受到了人們的重視。腎臟內皮素分泌于腎小管，其主要的作用部位

2、為腎近曲小管(Renal proximal tubule，RPT)。內皮素受體主要分為內皮素A型受體(Endthelin receptor A，ETAR)及內皮素B型受體(Endthelin receptor A，ETBR)，在腎小管系統(tǒng)中，ETBR主要分布于近端小管上皮細胞和內髓收集管道，而ETAR分布于遠端小管和皮質收集管道。兩種受體分布不同，發(fā)揮的作用也各不相同。大量研究表明，內皮素的利尿排鈉作用主要經由ETBR完成。研究發(fā)現(xiàn)，E

3、TBR既可通過直接抑制Na+-K-ATP酶活性參與調節(jié)水鈉排泄，還可通過與其他受體相互作用間接影響水鈉平衡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rat，SHR)，ETBR介導的尿鈉排泄功能降低，但機制不清。
　　由于ETBR屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled recetor, GPCR)，其功能主要受到G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein coupled

4、 recetor kinase，GRK)及蛋白磷酸酶2A(Proteinphosphatase2A，PP2A)的調節(jié)。我們的既往研究表明，在高血壓狀態(tài)下，PP2A活性未見異常，因此，GRK的作用顯得尤為重要。GRK家族主要有7個成員，其中GRK4的功能與血壓調節(jié)密切相關，并受到人們的重視。GRK4單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)與原發(fā)性高血壓的發(fā)病具有密切的關系，在人群研究中發(fā)現(xiàn)，GR

5、K4的3種變異體，分別為GRK4 A142V、A486V及R65L，均與原發(fā)性高血壓密切相關。GRK4變異體的存在會使GRK4活性增高。GRK4 A142V轉基因小鼠在正常飲食條件時即出現(xiàn)血壓升高，而人GRK4 A486V轉基因小鼠則只有在高鹽飲食條件下才會出現(xiàn)血壓升高，且我們既往對GRK4 A142V轉基因小鼠的血壓進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)該小鼠與對照小鼠相比，血壓明顯升高并伴有尿鈉排泄功能障礙，GRK4 A142V可以影響腎臟近曲小管多巴

6、胺D1R的磷酸化水平，進而使其利尿鈉排泄作用受損，而引起血壓升高。并且GRK4變異體A142V可通過增加血管AT1受體的表達，增加AngⅡ誘導的血管收縮，從而增高血壓，提示GRK4 A12V與原發(fā)性高血壓密切相關。然而以上這些仍不能完全解釋其血壓升高的原因，ETBR功能受損是否與腎臟GRK4活性升高有關，目前尚無報道。
　　基于以上我們提出假設，ETBR的功能受到GRK4的調節(jié)，GRK4變異體A142V的存在會導致GRK4對ETB

7、的調節(jié)發(fā)生異常，使ETBR介導的利尿鈉排泄作用受損，水鈉潴留，從而參與高血壓的發(fā)病機制。
　　研究目的：
　　本課題將研究高血壓狀態(tài)下ETBR介導的利尿排鈉功能，以及GRK4 A142V在ETBR功能受損中的作用。
　　研究方法：
　　1、觀察自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)及Wistar-Kyoto大鼠(WKY)基礎狀態(tài)下血壓;通過腎上腺動脈插管灌注ETBR激動劑BQ3020觀察ETBR介導的利尿排鈉作用;Weste

8、rn-blot及QT-PCR分析GRK4及ETBR的蛋白及mRNA表達。
　　2、觀察WKY及SHR細胞基礎狀態(tài)及給予ETBR激動劑BQ3020刺激后Na+-K+-ATP酶活性;觀察GRK4 siRNA干擾以及ETBR激動劑BQ3020刺激后SHR RPT細胞Na+-K+-ATP酶活性變化。
　　3、觀察GRK4 A142V及GRK4 WT轉基因小鼠基礎血壓，基礎狀態(tài)下尿量及尿鈉排泄功能;以及頸靜脈插管全身灌注ETBR激動劑

9、BQ3020后ETBR介導的利尿排鈉功能。
　　4、觀察GRK4 A142V及GRK4 WT質粒轉染小鼠基礎狀態(tài)下及給予ETBR激動劑BQ3020刺激后Na+-K+-ATP酶活性變化。
　　5、通過激光共聚焦觀察GRK4及ETBR共定位情況，免疫共沉淀檢測GRK4及ETBR共連接。
　　研究結果:
　　1.SHR大鼠血壓高于WKY大鼠，灌注ETBR激動劑BQ3020在WKY大鼠具有明顯的利尿鈉排泄的作用，在SHR

10、大鼠這種作用受損，伴有GRK4表達增高，兩者ETBR表達不變，但SHR大鼠磷酸化的ETBR增高，ETBR在WKY RPT細胞降低Na+-K+-ATP酶活性的作用，但這種作用在SHR RPT細胞受損，干擾GRK4后，這種作用可恢復，提示高血壓狀態(tài)下ETRR功能受損可能與GRK4活性增強有關。
　　2.GRK4 A142V轉基因小鼠血壓高于GRK4 WT轉基因小鼠，兩者的24小時尿量及尿鈉排泄率無差異，ETBR介導的利尿鈉排泄作用在G