GRK4對(duì)腎臟脂聯(lián)素受體促尿鈉排泄的調(diào)控在高血壓中的作用研究.pdf

1、研究背景:目前研究認(rèn)為，高血壓的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)系統(tǒng)。脂肪組織作為重要的內(nèi)分泌器官，所分泌的脂肪細(xì)胞因子如脂聯(lián)素、瘦素以及生物活性物質(zhì)如脂肪酸、前列腺素、血管緊張素原等，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)以及功能失調(diào)，被認(rèn)為是導(dǎo)致高血壓發(fā)病的重要原因。
　　在眾多的脂肪細(xì)胞因子中，脂聯(lián)素的作用尤其引人注目。脂聯(lián)素與高血壓的關(guān)系不僅得到臨床結(jié)果的佐證，也得到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)果的支持。臨床研究發(fā)現(xiàn)血漿脂聯(lián)素水平的改變

2、與高血壓密切相關(guān)。脂聯(lián)素敲除小鼠在高鹽誘導(dǎo)下表現(xiàn)為血壓升高，利用腺病毒過表達(dá)脂聯(lián)素可以降低肥胖小鼠的血壓。尿鈉重吸收增加，排泄受損是高血壓發(fā)病中的重要部分，但是脂聯(lián)素的腎臟作用、參與高血壓發(fā)生的機(jī)制等尚不清楚。
　　脂聯(lián)素受體分為兩個(gè)亞型：脂聯(lián)素受體1（AdipoR1）以及脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）。AdipoR1和AdipoR2在全身廣泛分布。研究顯示脂聯(lián)素的兩個(gè)受體亞型在腎臟均有高表達(dá)，并且脂聯(lián)素通過腎臟脂聯(lián)素受體對(duì)腎臟的

3、生理和病理調(diào)節(jié)起到了重要作用。初期研究也發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體在RPT細(xì)胞中的表達(dá)；腎臟灌注脂聯(lián)素發(fā)揮促尿鈉排泄作用，但高血壓狀態(tài)下該作用受損。
　　脂聯(lián)素受體雖不屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），但是卻能被G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)所磷酸化，其受體磷酸化是其功能改變的重要機(jī)制之一；既往的研究發(fā)現(xiàn)，在眾多的 GRK亞型中， GRK4活性增高早于高血壓發(fā)生而出現(xiàn)，其在高血壓中的作用受到人們關(guān)注。GRK4基因位于人類染色體4q16.3的位

4、置，與原發(fā)性高血壓相關(guān)。GRK4變異體出現(xiàn)的機(jī)率與血壓增高程度明顯相關(guān)。利用GRK4變異體對(duì)非洲加納人原發(fā)性高血壓的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)70％以上，而對(duì)日本人原發(fā)性高血壓的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)94%。對(duì)多個(gè)研究中心的研究結(jié)果所做的 Meta分析也顯示 GRK4變異體與高血壓發(fā)生的關(guān)系密切。GRK4變異體三個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠均表現(xiàn)為高血壓，GRK4?142V小鼠為顯性高血壓，A486和R65L小鼠在高鹽負(fù)荷的情況下表現(xiàn)為鹽敏感性高血壓。以此推測(cè) GRK4有可能

5、參與了腎臟脂聯(lián)素受體的磷酸化，從而參與了高血壓的進(jìn)展。所以，針對(duì)性抑制腎臟GRK4的表達(dá)可作為增強(qiáng)尿鈉排泄，從而改善高血壓的有效嘗試。
　　綜上所述，推測(cè)脂聯(lián)素具有利尿排鈉作用，該作用在高血壓狀態(tài)下喪失；其喪失的原因歸因于脂聯(lián)素受體發(fā)生磷酸化導(dǎo)致受體失活，歸因于腎臟GRK4表達(dá)和活性增高；抑制腎臟GRK4具有降血壓作用。
　　研究目的:研究脂聯(lián)素對(duì)腎臟利尿排鈉的影響及在高血壓發(fā)生發(fā)展中的作用。明確GRK4是否參與調(diào)控脂聯(lián)素受

6、體磷酸化從而對(duì)血壓進(jìn)行調(diào)節(jié)，超聲微泡靶向沉默腎臟GRK4是否對(duì)SHR大鼠的血壓和尿鈉產(chǎn)生影響。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　1.脂聯(lián)素在腎臟尿鈉排泄中的作用及其機(jī)制
　　1.1.采用免疫印跡以及免疫熒光染色的方法，觀察脂聯(lián)素2種受體 AdipoR1和AdipoR2，在正常血壓大鼠(WKY)腎臟及RPT細(xì)胞上的表達(dá)。
　　1.2.利用 WKY大鼠，通過單腎灌注不同濃度的脂聯(lián)素，觀察尿流量、尿鈉排泄率、以及血壓的變化以

7、明確脂聯(lián)素是否具有利尿作用。同時(shí)采用高溫滅活脂聯(lián)素蛋白活性的方法，以排除蛋白的滲透性利尿作用以及致敏作用。
　　1.3.在 WKY的 RPT細(xì)胞上，采用 Na+-K+-ATP酶活性檢測(cè)方法，觀察脂聯(lián)素作用不同濃度和時(shí)間后對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響。
　　1.4.實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證AdipoR1和AdipoR2的小干擾RNA（siRNA）的干擾效率，然后將AdipoR1和AdipoR2的siRNA轉(zhuǎn)染至RPT細(xì)胞中，觀察在脂

8、聯(lián)素受體受到抑制時(shí)，脂聯(lián)素對(duì)Na+-K+-ATP酶的作用，以明確何種受體介導(dǎo)脂聯(lián)素的作用。
　　1.5.采用 Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定技術(shù)，加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抑制劑Compound C、一氧化氮合酶(eNOS)抑制劑(L-NAME)初步篩選脂聯(lián)素抑制Na+-K+-ATP酶活性的信號(hào)通路。然后，采用免疫印跡法進(jìn)一步觀察在脂聯(lián)素作用后，磷酸化AMPK及其下游信號(hào)分子eNOS的磷酸化表達(dá)情況。
　　2.

9、脂聯(lián)素受體表達(dá)下調(diào)及 GRK4調(diào)控脂聯(lián)素受體磷酸化導(dǎo)致脂聯(lián)素促尿鈉排泄作用受損
　　2.1.采用同WKY大鼠相同濃度梯度的脂聯(lián)素，對(duì)SHR進(jìn)行單腎灌注。觀察尿流量、尿鈉排泄率以及平均動(dòng)脈壓的改變。
　　2.2.采用自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的RPT細(xì)胞，觀察脂聯(lián)素對(duì)Na+-K+-ATP酶的作用。
　　2.3.采用實(shí)時(shí)定量PCR觀察，比較于WKY RPT細(xì)胞，脂聯(lián)素兩個(gè)受體基因在SHR RPT細(xì)胞上的表達(dá)情況，同時(shí)，免疫

10、印跡方法檢測(cè)脂聯(lián)素受體的蛋白表達(dá)情況。
　　2.4.單腎灌注脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑即小分子化合物AdipoRon對(duì)SHR尿鈉排泄影響，以進(jìn)一步明確受損的脂聯(lián)素利尿作用來(lái)源于脂聯(lián)素受體的改變。
　　2.5.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)脂聯(lián)素兩個(gè)受體的過表達(dá)質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并在 SHR的RPT細(xì)胞上轉(zhuǎn)染，觀察脂聯(lián)素受體恢復(fù)表達(dá)后，脂聯(lián)素對(duì)Na+-K+-ATP酶的作用。
　　2.6.利用免疫共沉淀的方法，觀察在 SHR的 RPT細(xì)胞上，脂聯(lián)素

11、受體的磷酸化表達(dá)情況。
　　2.7.脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑AdipoRon灌注GRK4?142V轉(zhuǎn)基因小鼠（相比較于GRK4?WT小鼠，該小鼠的GRK4活性增強(qiáng)），觀察脂聯(lián)素受體參與的利尿作用是否受損。
　　2.8.篩選有效的GRK4 siRNA。觀察在SHR RPT細(xì)胞中，干擾GRK4表達(dá)后，脂聯(lián)素受體磷酸化程度。
　　3. GRK4超聲微泡靶向治療改善SHR脂聯(lián)素受體磷酸化并調(diào)節(jié)尿鈉排泄與血壓
　　3.1.利用5-

12、羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的超聲微泡對(duì) GRK4 siRNA進(jìn)行包裹。
　　3.2.將超聲微泡注射到 SHR，在腎臟進(jìn)行超聲微泡靶向破壞技術(shù)（UTMD）釋放出GRK4 siRNA。20天后，觀察SHR血壓以及24小時(shí)（h）尿量、尿鈉排泄率，以及腎功能指標(biāo)和腎纖維化指標(biāo)。
　　3.3.取UTMD傳輸GRK4 siRNA至SHR大鼠腎臟，采用免疫共沉淀方法，觀察脂聯(lián)素受體磷酸化情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.脂聯(lián)素受體

13、AdipoR1以及AdipoR2在腎臟近曲小管均有表達(dá)，特別是腎臟皮質(zhì)，在RPT細(xì)胞表達(dá)豐富。AdipoR1的蛋白條帶為43Kd，AdipoR2的蛋白條帶為44Kd。
　　2.脂聯(lián)素對(duì)WKY大鼠具有促尿量和尿鈉排泄的作用，該作用呈現(xiàn)濃度依賴性
　　3.脂聯(lián)素對(duì)WKY RPT細(xì)胞上的Na+-K+-ATP酶活性產(chǎn)生抑制作用，該作用呈現(xiàn)濃度和依賴性。
　　4.為研究脂聯(lián)素作用的特異性，采用siRNA在WKY RPT細(xì)胞中敲低

14、AdipoR1和AdipoR2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用消失。
　　5. Na+-K+-ATP酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入AMPK阻斷劑和eNOS阻斷劑后，脂聯(lián)素對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用消失。同時(shí)，脂聯(lián)素增加了磷酸化AMPK以及eNOS的表達(dá)，同時(shí)采用AMPK阻斷劑后，脂聯(lián)素對(duì)eNOS磷酸化增強(qiáng)的作用消失，說明脂聯(lián)素通過AMPK-eNOS信號(hào)途徑對(duì)WKY RPT細(xì)胞上的Na+-K+-ATP酶活性產(chǎn)

15、生抑制作用。
　　6.脂聯(lián)素的利尿作用在SHR中受損。脂聯(lián)素對(duì)Na+-K+-ATP酶的抑制作用在SHR的RPT細(xì)胞中同樣受損。脂聯(lián)素的作用得到了脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑AdipoRon的佐證：即：AdipoRon具有利尿作用，該作用在SHR喪失。
　　7. SHR腎臟脂聯(lián)素受體表達(dá)量低于對(duì)照WKY大鼠，但其受體的表達(dá)量改變難以解釋其功能喪失，因?yàn)檫^表達(dá)AdipoR1和AdipoR2后，其利尿作用仍不能恢復(fù)，說明還有其它因素參與。由于

16、脂聯(lián)素受體的磷酸化影響受體功能，研究發(fā)現(xiàn)SHR腎臟脂聯(lián)素受體磷酸化水平升高，提示高磷酸化水平可能是脂聯(lián)素受體功能下降的原因。
　　8.為驗(yàn)證GRK4是否參與調(diào)控脂聯(lián)素受體磷酸化過程，采用GRK4?142V轉(zhuǎn)基因小鼠灌注脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑，發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體參與調(diào)節(jié)的利尿作用消失。在SHR的RPT細(xì)胞中采用GRK4 siRNA干擾后，脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2的磷酸化程度減弱。這說明GRK4參與調(diào)控了脂聯(lián)素受體的磷酸化，而脂

17、聯(lián)素促尿鈉排泄作用的受損和脂聯(lián)素受體在SHR中發(fā)生磷酸化相關(guān)。
　　9.采用微泡包裹GRK4 siRNA,在SHR的腎臟進(jìn)行靶向定位超聲破碎微泡，釋放出的GRK4 siRNA對(duì)GRK4產(chǎn)生抑制作用，腎臟脂聯(lián)素受體的磷酸化水平減弱，SHR大鼠尿鈉排泄增加，血壓下降。同時(shí)，SHR腎功能未受到影響，腎纖維化得到改善。
　　結(jié)論:脂聯(lián)素具有促腎臟尿鈉排泄作用，在高血壓狀態(tài)下，這一功能受損；檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體表達(dá)下調(diào)，但過表達(dá)受體后并