心肌細胞缺氧和紅景天苷干預(yù)的差異性表達蛋白的SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析及線粒體相關(guān)的機制研究.pdf

1、目的:心肌細胞缺氧過程中始終伴隨著可能誘導(dǎo)細胞損傷（壞死、凋亡等）的能量代謝變化，這些變化在心血管疾病進程方面起著至關(guān)重要的作用。紅景天苷(Salidroside，SAL)是紅景天的有效成分之一，近年來有研究表明SAL具有抗心肌缺氧、保護心臟功能等作用。本研究旨在通過氯化鈷(CoCl2)體外刺激H9c2大鼠心肌細胞制備化學(xué)缺氧模型，應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析缺氧組和SAL干預(yù)組心肌細胞蛋白表達差異，分析線粒體三羧酸循環(huán)相關(guān)酶和凋亡相關(guān)的

2、線粒體信號途徑分子的表達變化，探討SAL對缺氧心肌的保護作用機制。
　　方法:以H9c2大鼠心肌細胞為靶細胞，使用不同劑量CoCl2刺激H9c2細胞，篩選適宜的CoCl2刺激濃度，對照組加入等量的DMEM高糖培養(yǎng)基;使用不同濃度SAL預(yù)處理H9c2細胞不同時間，再以適宜的CoCl2濃度刺激細胞，篩選最佳的SAL保護濃度，對照組加入等量的DMEM高糖培養(yǎng)基。采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記細胞(SILAC)結(jié)合質(zhì)譜的方法篩選缺氧組、紅景天苷預(yù)處理

3、組和對照組的差異表達蛋白，運用The Databasefor Annotation，Visualization andIntegrated Discovery(DAVID)生物信息學(xué)對數(shù)據(jù)進行分析。Hochest33342染色觀察細胞形態(tài)學(xué)變化;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡比例;熒光探針檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度變化;化學(xué)發(fā)光分析法檢測細胞內(nèi)ATP濃度變化;Western Blot檢測琥珀酰輔酶A連接酶1(SUCLG1)、琥珀酰輔酶A連接酶2(S

4、UCLG2)、蘋果酸脫氫酶2(MDH2)、Cleaved-caspase-3、caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表達。。
　　結(jié)果:
　　1 CoCl2對H9c2細胞的半數(shù)抑制濃度為500μmol/L:根據(jù)文獻以CoCl2500μmol/L為中心，雙向擴大刺激濃度范圍為300，400，500，600和700μmol/L。分別刺激H9c2細胞24 h，對照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基。MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):CoCl2300

5、，400，500，600和700μmol/L組細胞存活率明顯受到抑制，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），細胞活性隨CoCl2濃度增加呈現(xiàn)遞減趨勢，進一步實驗發(fā)現(xiàn)CoCl2對H9c2細胞的半數(shù)抑制濃度為500μmol/L，故選取500μmol/L為后續(xù)實驗中CoCl2的刺激濃度。
　　2常氧狀態(tài)下SAL對H9c2細胞無明顯增殖作用:根據(jù)文獻以SAL(1，10，100，1000 nmol/L)分別作用于H9c2細胞12，24，

6、36 h，對照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基。MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)SAL濃度為1000 nmol/L作用于H9c2細胞12，24，36 h時，細胞存活率下降，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05); SAL濃度為1，10，100 nmol/L作用于H9c2細胞12，24，36 h時，細胞存活率無明顯變化，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明，常氧條件下，SAL對H9c2細胞無明顯增殖作用，故選取24 h為后續(xù)實驗中SAL的作用時間。

7、>　　3低氧狀態(tài)下SAL使H9c2細胞活力升高:以不同濃度SAL(1，10，100，1000 nmol/L)預(yù)處理細胞24 h，隨后細胞暴露于500μmol/L CoCl2的低氧環(huán)境下持續(xù)培養(yǎng)24 h，對照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基。MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):1，10，100，10000 nmol/L SAL均能抑制CoCl2誘導(dǎo)的H9c2細胞毒性作用，并且SAL濃度為100 nmol/L時效果最明顯(P＜0.05)，故選取SAL100 nm

8、ol/L為后續(xù)實驗中SAL的預(yù)處理濃度。
　　4蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的定量比較分析:在穩(wěn)定同位素正反標(biāo)記的四個實驗組中，共發(fā)現(xiàn)5088個蛋白(protein level FDR＜1％)，其中838個同時存在于四個實驗組中;進一步實驗發(fā)現(xiàn)缺氧組與正常組相比，共鑒定到30個上調(diào)蛋白和62個下調(diào)蛋白;SAL預(yù)處理組與缺氧組相比，共鑒定到70個上調(diào)蛋白和36個下調(diào)蛋白。
　　5基因功能分析:將鑒定有意義的上調(diào)和下調(diào)蛋白進行DAVI

9、D生物學(xué)進程和細胞組分分析，結(jié)果均表明SAL保護缺氧H9c2細胞的作用機制主要集中于細胞糖代謝如乙酰輔酶A代謝、三羧酸循環(huán)(TCA cycle)、氧化呼吸等生理過程，其中SAL對三羧酸循環(huán)酶SUCLG1，SUCLG2，MDH1和MDH2的調(diào)控作用尤為突出。
　　6 SAL能降低低氧環(huán)境誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡:倒置顯微鏡下觀察H9c2細胞的形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)正常貼壁的H9c2細胞形態(tài)為梭形，但經(jīng)過CoCl2誘導(dǎo)的缺氧刺激后，細胞變成鵝卵

10、石樣甚至圓形，細胞皺縮，部分從培養(yǎng)皿底部脫落;同時，這些細胞形態(tài)學(xué)變化在SAL抗缺氧組的細胞中表現(xiàn)不明顯。Hoechst33342實驗檢測H9c2細胞核水平發(fā)現(xiàn)當(dāng)細胞暴露于500μmol/L CoCl224 h后，與正常組相比，出現(xiàn)細胞核皺縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等變化，但這些變化在經(jīng)SAL100 nmol/L預(yù)處理24 h的抗缺氧組細胞中不明顯。FITC-annexinⅤ和PI雙染的流式細胞術(shù)實驗發(fā)現(xiàn)缺氧組的細胞凋亡率顯著增加，而

11、SAL100 nmol/L預(yù)處理24 h組能明顯逆轉(zhuǎn)此趨勢。
　　7 SAL能有效提升細胞線粒體膜電位（ΔΨm）
　　8 SAL能維持細胞內(nèi)外鈣穩(wěn)態(tài):缺氧組細胞較正常組細胞有明顯的鈣超載趨勢，同時紅景天抗缺氧組細胞的鈣離子熒光信號強度較缺氧組明顯削弱（P＜0.05）。
　　9 SAL能有效抑制ROS形成
　　10 SAL能顯著抑制CoCl2誘導(dǎo)的ATP大量消耗（P＜0.05）。
　　11 SAL具有調(diào)節(jié)三羧

12、酸循環(huán)的功能:SAL100 nmol/L預(yù)處理H9c2細胞24 h，繼而持續(xù)暴露于500μmol/L CoCl224 h，各組內(nèi)參β-actin的表達一致; SUCLG1，SUCLG2表達量均較對照組顯著降低;MDH2表達量較對照組上調(diào);SAL預(yù)處理組能逆轉(zhuǎn)此趨勢(P＜0.05)。
　　12 SAL能有效抑制線粒體凋亡途徑:與對照組相比，缺氧組caspase9和活化caspase3蛋白表達水平急劇上升;與缺氧組相比，SAL預(yù)處理組

13、caspase9和活化caspase3蛋白表達水平明顯下降(P＜0.05)。
　　13 SAL能有效調(diào)節(jié)Bcl-2家族相關(guān)蛋白表達從而抑制細胞凋亡:與正常組相比，缺氧能顯著下調(diào)Bcl-2（抑制凋亡）蛋白表達量，并上調(diào)Bax（促進凋亡）蛋白表達量;與缺氧組相比，SAL預(yù)處理24 h組能明顯逆轉(zhuǎn)上述Bcl-2和Bax表達變化趨勢(P＜0.05)。
　　結(jié)論:SAL通過調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)相關(guān)的催化酶、增高線粒體膜電位水平、抑制ROS生