人胚胎生殖細胞向心肌細胞誘導分化及蛋白質(zhì)組學分析.pdf

1、目的:
　　 1.利用抗壞血酸誘導人胚胎生殖細胞(human embryonic germ cells，hEGC，人EG細胞)向心肌細胞分化;
　　 2.利用半定量RT-PCR的方法鑒定人EG細胞和誘導后心肌細胞表達GATA-4和ACTC1等基因的情況;3.結(jié)合生物信息學的方法推斷分化過程中相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系。
　　 方法：
　　 取5-10周人胚胎生殖腺嵴，以同源人胚胎成纖維細胞為飼養(yǎng)層，組織塊培養(yǎng)

2、法原代培養(yǎng)人EG細胞。將生長良好的人EG細胞，接種于細菌培養(yǎng)皿中進行懸滴、懸浮培養(yǎng)，7天后將形成的擬胚體置于明膠包被的24孔培養(yǎng)板中，加入含0.1mg/ml抗壞血酸的誘導液進行誘導分化培養(yǎng)，免疫熒光法檢測誘導2周后細胞心肌連接蛋白Cx43的表達;通過CCK-8法測定誘導后心肌細胞增殖率。設實驗組（誘導后的心肌細胞）和對照組（未經(jīng)誘導的人EG細胞），提取各組細胞的RNA，用紫外分光光度計檢測所提 RNA的質(zhì)量與濃度，并進行GATA-4、A

3、CTC1、nkx2.5、KRIT1、Anxa2、VDAC1及CSRP3的RT-PCR反應，取8μL PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀保存圖像。通過“NCBI”等相關(guān)網(wǎng)站研究不同組細胞之間差異蛋白的空間結(jié)構(gòu)，及其相互作用關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的人EG細胞增殖旺盛，其集落呈典型的“鳥巢”狀。人EG細胞經(jīng)抗壞血酸誘導2周后，陽性表達Cx43，細胞形態(tài)多為梭形，并且分化的細胞不斷增殖。半定量RT

4、-PCR結(jié)果顯示，由人EG細胞分化的心肌細胞表達心肌特異基因GATA-4、ACTC1、Nkx2.5;而各組細胞中均檢測到KRIT1、Anxa2等非心肌特異基因的表達，只是表達強度有所不同，且符合質(zhì)譜分析結(jié)果。GATA-4、Nkx2.5與各類心肌肌鈣蛋白有著密切的聯(lián)系。
　　 結(jié)論:
　　 人EG細胞在抗壞血酸的誘導下可分化為心肌細胞。通過篩選經(jīng)質(zhì)譜分析得到差異蛋白質(zhì)中與分化相關(guān)的重要蛋白，研究其結(jié)構(gòu)與功能，可為探討人EG